烟草的组织培养技术.pdfVIP

烟草的组织培养技术 一、 目的与要求 1. 验证“植物细胞全能性”理论 。 2. 学习用生长调节剂对植物器官发生的诱导方法。 二、 实验原理 植物组织培养 是指在无菌条件下，分离、并在培养基中培养离体植物组织 （器官或细胞）的技术。植物组织培养的理论依据是 植物细胞的全能性， 即植物 体的每个活细胞都有相同的遗传组成，在适当条件下具有繁殖出完整植株的能 力。 植物组织当中原本已经分化的细胞，组织、器官一旦脱离原有的机体环境， 成为离体状态， 在适宜的营养和外界条件下， 就会表现出细胞的全能性， 从已经 分化的细胞通过 脱分化 ，成为重新具有分裂能力的胚性细胞， 并能 再分化 重新生 长发育成完整的植株。 愈伤组织： 是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分 化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形 成了无序结构的细胞团。 脱分化：已经分化的细胞，发生生理、生化的改变，退回到胚性细胞的过程。 再分化： 经过脱分化的细胞或组织再次获得分化成不同功能的细胞、组织、 器官或完整植物体。 三、 材料和用具 1. 材料：无菌烟草叶盘（已经诱导成芽） ，拟南芥。 2. 用具：超净工作台、高压灭菌锅、培养箱、电子天平、移液器、手术解 剖刀、大、小镊子、 30ml 烧杯、 500ml 烧杯、药勺、玻璃棒、培养 瓶、平皿、试纸（ PH5.4-7），报纸等。 3. 试剂： MS 培养基、 0.5mol/LNaOH 、1mol/L HCl 。 四、 操作步骤 诱导培养基配制 （一） （见表1） 1. 加 MS 储液（储液配置见附表） 大量元素和微量元素的母液都是高浓度的，为防止混合后发生沉淀， 建议加完大量元素后先加水 （约总体积3/4 ），再加各微量元素和有机成分。 铁盐也是微量元素，因为易发生沉淀，所以与其它微量元素分开配。储液 中的铁盐存于棕色瓶中。配好的储液应当 4 ℃保存。表 1 是 4 瓶培养基（ 1 组）的配置方案。 表 1 诱导培养基配制表 成分 实际称取量 蒸馏水 120 ml MS 母液 15 mL 蔗糖 4.5 g 用蒸馏水粗略定容至 100ml pH 值 5.8 琼脂 1.2 g 2. 加蔗糖（ 3% ）（m/v ）。蔗糖是碳源，同时起到维持渗透压的作用。 3. 调 pH=5.8 。pH 过低，高温处里时间过长，都可能会使培养基不凝。 4. 加琼脂（ 0.7-0.8%）（m/v ）琼脂粉是固化剂、支持物。 （二）灭菌 1. 培养基、解剖刀、镊子、平皿需在高压灭菌锅 120℃，灭菌 15min。 2. 接种前打开无菌间和超净台紫外灯照射 30min 。 3. 用肥皂洗手和手腕。 进入无菌间， 先用 70%酒精或新洁尔灭喷手。 关掉 无菌间棚顶紫外灯，打开超净台风机，关掉超净工作台上的紫外灯。 （三）接种 1. 坐在超净