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细胞培养 无菌操作基本技术 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70% ethanol 擦拭无菌操作抬血，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。毎次操作只处理一?株细胞 株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工 作台，以70% ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再讲行下一个细 胞株Z操作。 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放 置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70% ethanol擦拭笊才带入无菌操作台 内。实验操作应在抬面之屮央无菌区域，勿在边缘Z非无菌区域操作。 小心取用无菌Z实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开Z容器 正上方操作实验。容器打开示，以于夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽暈勿将瓶盖盖口朝上放 置桌面。 工作人员应注意H身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来白人类或是病毒感染Z细 胞株应特别小心操作，并选择适当等级Z无菌操作台(至少Class II)o操作过程屮，应避免引起aerosol Z产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头Z伤害等。 定期检测下列项目： CO2钢瓶Z CO2压力。 CO2培养箱ZCO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 无菌操作台内Z airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网， 3000 小时/HEPA)。 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750),定期更换水槽的水。 实验用品 种类： 1.1?细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet外，其它均为槊料无菌制品。 TC级培养盘表面均H coating高分了物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask, plates, dishes, roller bottle等，依实验需要使用。 plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 塑料离心管:15 ml, 50 ml,均有2种不同材质,其中polypropylene (PP)为不透明材质,polystyrene (PS)为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 glass pastuer pipet: 9 inch,用以抽掉废弃培养液等。 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)： 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml。 清洗： 新购玻璃血清瓶先以0.1?0.05NHC1浸泡数小时，洗净后才开始使用。 用过之玻璃血清瓶，以高斥蒸汽灭菌，洗净示分别用一次与二次去离了水冲洗干净，勿加清洁剂 清洗。 灭菌： 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽火菌121°C,151b,20分钟，置于oven屮烘干。 实验用玻璃pasteur pipet以十?热灭菌170°C, 4小时。 液体或是尚体废弃物可用10 % hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高压灭菌121 °C, 15 lb, 20分钟处理。 培养基 液体培养基贮存于4°C冰箱，避免光照，实验进行前放在37°C水槽屮温热。 液体培养基(加血清)存放期为六个月，期间glutamine W能会分解，若细胞生长不佳，可以再添 加适量 glutamineo 粉末培养基配制(以1升为例)： 细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基2配制体积为900 ml, pH为727.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH Z谋旁，或局部过碱。因此粉末培养基 及NaHCO3粉末丿卫分别溶解麻才混合，然JhJIJ CO2气体调整pH,而非川强酸(HC1)或强碱(NaOH),因为 氯离了对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。 32材料?： 纯水(milli-Q水或二次至三次蒸锢水，水品质非常重要)，粉末培养基，NaHCO3,电磁搅拌器，无 菌血清瓶，0」或0.2 mm无菌过滤膜，pH计，真空泵，CO2气体 步骤： 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q水屮，搅拌使其溶解。 称取适量之NHCO3粉末溶于200ml milli-Q水屮，搅拌使其溶解，然示通入CO2气体至饱和, 约3-5分钟。 将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解Z液体培养基中混合。混后溶液之pH应为 7.2?7.4,除非pH值偏茅太大，否则不需用酸碱再调整Z。若为太碱，可再通入CO2气体调整pH。培养 基以真空帮