基于1,2,4-三氮唑并吡啶合成新策略的次氯酸荧光探针构建及生物应用研究.pdf

摘要 摘要 活性氧（Reactiveoxygen species,ROS）是生物系统中与氧代谢密切相关的一类氧化 性物质。作为一种高活性ROS，内源性次氯酸 （Hypochlorousacid,HOCl）在氧化应激 相关的正常生理过程和异常病理过程中均起着至关重要的作用，因此，需要建立能够实 时原位监测内源性HOCl细微变化且不受其他活性氧干扰的检测方法。开发具有高特异 性、高灵敏度、高时空分辨率的荧光探针是解决该问题的有效途径。本论文发现HOCl 可特异性诱导2-吡啶腙生成1,2,4-三氮唑并吡啶。利用该反应，本论文不但报道了HOCl 参与的1,2,4-三氮唑并吡啶新合成方法，并且基于该反应设计开发了一系列高灵敏、高 选择性、具有良好生物相容性的新型HOCl 荧光探针。具体研究内容如下： 1. 本文首先设计合成了6个2-吡啶腙衍生物N1-N6。随后，N1-N6作为底物与HOCl 反应合成了相应的1,2,4-三氮唑并吡啶类产物NT1-NT6。在所构建的底物中，N6 是一 个含有2-吡啶腙的新型Rhodol 类化合物，但因吡啶腙的C N 键异构化而存在荧光猝灭 现象。当N6 与HOCl 发生反应生成刚性的NT6 时，荧光得以恢复。因此，N6 可作为 基于“三氮唑并吡啶生成”新策略的HOCl 荧光探针分子。实验结果显示，N6 对HOCl 的检测具有较高的选择性与灵敏度，检出限仅5.3nM。此外，N6 被进一步成功应用于 活细胞和斑马鱼中内源和外源性HOCl 的荧光成像。 2. 线粒体HOCl 与线粒体中的氧化还原平衡密切相关，对其进行实时原位靶向检测 对HOCl相关疾病的检测和预防具有重要意义。本论文基于上述 “三氮唑并吡啶合成” 新策略，在包含2-吡啶腙的Rhodol 分子骨架上引入三苯基膦作为线粒体定位基团，开 发出了一种可实时原位靶向线粒体进行HOCl检测的新型HOCl 荧光探针NM1。在体外 实验中，NM1可以在数秒内实现对HOCl 的检测，检出限低至2.2nM。在线粒体共定 位实验中，NM1和商业化线粒体染料MitoTracker Green 共孵育活细胞成像结果显示皮 尔森系数为0.94，说明探针具有良好的线粒体定位能力。NM1进一步被成功应用于脂 多糖（LPS）刺激下活HepG2 细胞中和斑马鱼体内产生的内源性HOCl 的荧光成像研究。 关键词：1,2,4-三氮唑并吡啶，2-吡啶腙，荧光探针，活性氧，次氯酸 I 缩略语对照表 缩略语对照表 缩略语 英文名称 中文名称 HUMO Highest OccupiedMolecular Orbital 最高已占轨道 LUMO LowestUnoccupiedMolecular Orbital 最低未占轨道 NBS N-Bromosuccinimide N-溴代丁二酰亚胺 AIBN Azobisisobutyronitrile 偶氮二异丁腈 DMEM DulbeccosModifiedEagleMedium 改良伊格尔培养基 3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-Dip 3- （4，5-二甲基噻唑-2） MTT henyl-2-H-TetrazoliumBromide -2，5-二苯基四氮唑溴盐 LPS Lipopolysaccharide 脂多糖 ABH 4-AminobenzoicHydrazide 4-氨基苯甲酰肼 3-AminobenzoicAcidEthyl Ester 间氨基苯甲酸乙酯甲磺 MS222