【国自然】用慢病毒RNA干扰系统研究精子发生相关基因znf230的功能.docxVIP

摘要： 项目研讨内容和含义简介（限400字）： RNA搅扰（RNA interference,RNAi）是由双链RNA介导的序列特异性的mRNA降解所造成的的转录后基因缄默沉静进程。RNAi技能可方便方便地研讨基因的功用，并用于功用基因的挑选。本课题拟选用RNAi及胚胎干细胞体外定向分解技能，将我室新克隆的精子发生相关基因znf230的siRNA经过慢病毒（Lentivirus）体系引进小鼠胚胎干细胞，体外模仿精子发生进程，而在细胞水平上研讨znf230基因表达受抑后对生精的影响，隔阂结合基因表达谱芯片及蛋白组二维电泳-质谱技能完结基因功用性及蛋白质表达筛查，以期全面研讨该基因的功用。上述技能渠道的树立将供给一个精子发生相关基因功用研讨的模型，亦为RNAi技能的使用研讨拓宽了新的思路。这一想象没有见文献报导，如能证明其合理有用，将成为难于判定表型且反常表达的基因功用研讨的通用模型，并在后续蛋白组学及基因相关药物的研制中发挥重要作用。 陈述正文 （一）立项根据与研讨内容（4000-8000字）： 项意图立项根据（附首要的参考文献目录） 人类基因图谱解码分道扬镳完结。进入功用基因组学时代后，疾病相关基因以及重要功用基因的别离、定位、克隆表达已日益加快。而跟着新基因的别离与判定，对这些基因的功用进行体系的研讨将成为这一时期的首要任务。因而，树立或开发新的或有用的基因功用研讨技能渠道具有重要含义。 在功用基因组研讨中，酵母杂交体系、DNA芯片、反义RNA、基因敲除(gene knock-out)等技能为解读基因功用供给了有用的手法。其间基因敲除虽是基因功用研讨的经典技能[1]，但因为外源及靶DNA发生同源重组的几率极低，重组体的挑选及检测即成为该技能的瓶颈，难以习惯大规模的基因功用研讨。近年来开展起来的RNA搅扰(RNA interference，RNAi)技能作为特异性按捺基因表达的办法，已成为生命科学范畴研讨的热门。其长处是能够简洁地制备特定基因缺失表型的个别，较方便地研讨意图基因的功用，并使体系性、高通量功用基因挑选成为或许。 RNAi现象首要在秀美新小杆线虫(C.elegans)中被发现。它经过双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)介导的同源靶mRNA的特异性降解，在转录后水平使基因缄默沉静(Post Transcriptional Gene Silencing, PTGS)[2,3]。RNAi技能现已成功运用于线虫、果蝇、植物、真菌和脊椎动物等生物体的功用研讨中[4,5]，而在哺乳动物细胞内转染21-25 nt长度的siRNA也能够诱导特异性的基因缄默沉静[6]，尽管这种效应具有瞬时性。现在，多个研讨小组[7-10]已将靶向特异基因的shRNA表达质粒导入细胞，在聚合酶Ⅲ依赖性H1或U6启动子操控下取得siRNAs的继续表达并导致了靶基因特异、继续的下调，这为RNAi用于长时间功用缺失型研讨供给了新的思路。但是，现在在RNAi使用研讨中仍存在如下一些问题亟待处理，如： shRNA表达载体对某些靶基因虽能取得较显着的RNAi效应，但大都仍呈瞬时性，且遭到转染功率、细胞类型等要素的约束，难以取得长时间的“knockdown”效应。 2）并非全部的安排或细胞的靶基因对RNAi灵敏；某些基因的表型判定本身就存 在困难，必定条件下需用特定的基因传递体系在模型中加以证明。 3）意图基因序列上siRNA模板的挑选无统一标准。实际操作中往往是试探性的，选 择不同序列RNAi效应不同大，按捺率可从0～90％不等。 因而，树立高效、安稳长时间表达的RNAi传递体系正是该范畴现在研讨的要害。尽管逆转录病毒的运用能有用地下降靶基因的表达[11]，但MMLV类病毒本身特征及对细胞类型的挑选性使其使用遭到必定的约束。当时，新式第三代慢病毒(Lentivirus)体系正以其高效、安稳的特性在RNAi研讨中倍受重视。Lentivirus来源于HIV-1病毒，其宿主细胞规模广泛，包含割裂细胞、非割裂细胞、原始细胞等，且转基因在生殖体系中可安稳传递[12,13]。Pfeifer[14]等的研讨成果标明，Lentivirus介导的转基因均可在鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem, ES)体内、外分解进程中表达，将Lentivirus感染的ES细胞注入胚泡期或桑椹期胚胎，发育的重生鼠及其子代的多种安排中均可检测到转基因。Tiscornia[15]等将缄默沉静GFP的Lentivirus感染GFP阳性转基因鼠卵细胞，发现重生鼠体内GFP荧光蛋白的表达显着下降。Rubison[16]等运用CD8/CD25 siRNA 的Lentivirus载体转染鼠ES细胞，生成了 “knockdown”转基因鼠，其效应保持长达30天之久并可传递下