【国自然】日本血吸虫（中国大陆株）尾蚴的性别鉴定.docxVIP

挂号序号 项目编号 科研规划书 项目名称： 日本血吸虫尾蚴性别判定应用技能的研讨 承当单位： 单位地址： 邮政编码： 开 户 行： 帐 号： 1103021109000077488 项目负责人： 电 话： 职务职称： 填写日期 2004年7月28日 江苏省地方病协会 二○○四年制 立项依据：血吸虫是一具有两性染色体的吸虫，有8对染色体，其间雌性性染色体为异配子体（ZW），雄性为同配子体（ZZ）。虽然雌性和雄性成虫阶段具有显着的性别二态性，可用肉眼差异，但在幼虫阶段即毛蚴、胞蚴和尾蚴阶段，无显着的性别二态性，肉眼难以差异。传统动物感染办法，是在实验室内取感染了血吸虫的鼠或其它啮齿类动物的肝、肠或粪便搜集虫卵，孵化毛蚴，用单只毛蚴感染单只钉螺，饲养选择阳性钉螺，取得单性尾蚴，用以感染啮齿动物，待其发育至成虫阶段，解剖动物搜集成虫，用肉眼或在解剖显微镜下依据形态学的差异，确认感染尾蚴性别。但是，单性雌性尾蚴不能发育到彻底老练的成虫，给辨别带来必定困难。隔阂惯例办法需求花费时间长，日本血吸虫从尾蚴感染动物到发育老练至少需3周。选用分子生物学的办法，可快速判定尾蚴的性别。代表性差异剖析（RDA）办法是依据递减杂交法，用于发现两DNA基因组群间差异，是一种改进的扣除杂交法，并可用于别离基因组间差异性片段。因为血吸虫为两性染色体的吸虫，其雄性为同性配子体（ZZ），而雌性为异性配子体（ZW）。RDA办法从微观上看，系用雄虫染色体ZZ去扣除雌虫染色体中的Z，然后取得W染色体。Drew A.C.等（1995）选用此办法别离出两段曼氏血吸虫雌性特异性序列，并将其制备成探针，用Southern blot 办法证明只与曼氏血吸虫雌性基因组DNA特异性杂交。W1重复序列作为雌性特异性序列，存在于曼氏血吸虫波多黎各株生活史的各个阶段。并依据曼氏血吸虫雌性该特异性序列W1规划出一对引物W1a和W1b。直接参加该引物对单个尾蚴作PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳。效果雌性尾蚴出现扩增产品PCR-W1条带，雄性尾蚴不出现扩增条带。此办法能快速、可靠地用来判定曼氏血吸虫尾蚴的性别。依据曼氏血吸虫尾蚴性别判定的现有办法，为探究合适日本血吸虫尾蚴性别判定办法供给了理论和办法依据。使用代表性差异剖析（RDA）办法，别离出日本血吸虫雌性特异性序列，将此特异性序列制备成DNA探针，用Southern blot 办法判定日本血吸虫尾蚴性别。也可对此特异性序列进行测序，规划一对引物，对单个尾蚴的DNA作PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，则雌性尾蚴出现扩增条带，雄性则不出现扩增条带，然后用PCR办法可快速判定日本血吸虫单个尾蚴的性别。研讨日本血吸虫尾蚴的性别判定技能，树立日本血吸虫尾蚴快速判定应用技能有助于血吸虫幼虫阶段生物学和生理学实验的研讨；对血吸虫病疫苗点评办法的标准化、遗传学的研讨；及其流行病学、感染确诊和病理学研讨效果的正确点评；不同性别尾蚴的易理性和感染比率以及减虫率（减雌率）和减卵率的正确评价等均具有重要的含义。隔阂为进一步开发合适我国国情的日本血吸虫尾蚴性别判定试剂盒打下根底。 首要研讨内容、关键技能、方针： 研讨内容1.1 用代表性差异剖析办法取得日本血吸虫雌性基因组DNA特异性序列。1.2 对特异性序列测序，规划引物，PCR扩增。1.3 实验室内树立一种简略、快速的日本血吸虫尾蚴性别判定办法。 关键技能2.1 日本血吸虫雄虫、雌虫基因组DNA的提取2.2 代表性差异剖析办法（RDA）和PCR。2.3 低熔点凝胶收回雌性特异性片段2.4 大肠杆菌E.coli TG1感触态细胞的制备技能、DNA的重组和克隆选择、重组DNA的转化及质粒DNA的提取。2.5 DNA探针的制备和Southern blot 验证办法2.6 雌性特异性序列测序和引物规划。 方针 树立一种简略、快速、活络的日本血吸虫尾蚴性别判定办法。 研讨办法及技能道路 用传统办法确认尾蚴的性别，获取单性尾蚴样本 以逸蚴法选择出阴性钉螺用于感染，一切用于实验的螺均选择3次。1.2 以单只毛蚴感染单只钉螺；螺感染后在光照培育箱中饲养90天或在春夏日室温条件下饲养100天。逸蚴法选择出阳性钉螺，取单性尾蚴感染小鼠，35天后剖杀，取成虫确认尾蚴的性别。并别离搜集单性尾蚴别离编号保存于-70℃液氮备用。 用代表性差异剖析办法别离日本血吸虫雌性特异性序列2.1 感染家兔4只，每只约用1500-1800条尾蚴。45天后剖杀家兔，搜集成虫，在解剖镜下将成虫男女分隔，别离保存于-70℃液氮中备用。2.2 取雌虫、雄虫各200条用基因组DNA提取试剂盒别离提取雌虫和雄虫的基因组DNA。2.3 用限制性内切酶HindⅢ对雌虫、雄虫DNA进行酶切。将酶切产品与两条适配子（R Hind24,5’-AGCACTC