线粒体的分离与观察.docVIP

实验八线粒体的分离与观察 教学目标：了解细胞匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理。了解提取线粒 体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的线粒体的一般 形态，增加对线粒体的感性认识。掌握詹娜斯绿B染线粒体的方法。 重点：掌握用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。掌握詹娜斯绿B染线粒体 的方法。 U!难点：蔗糖密度梯度离心加样操作技能。 U! 授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或具体指导。 五.教学内容： 实验原理 制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质屮进行差速离心。 在一给定的离心场屮，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在 均匀悬浮介质屮离心一定时间内，组织匀浆中的各种cell器及其它内食物，由于沉降速度不同将 停留在不同的位置。细胞辭屮最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶 液，它比较接近细胞的分散相，在一定稈度上能保持细胞器的结构和酶的活性。 线粒体的鉴泄用詹纳斯绿活染法，詹纳斯绿B是对线粒体专一的活细胞染料毒性很小，属 于碱性染料，解离后带正电，由此吸引堆积在线粒体膜上，线粒体cell色索氧化酶，使该料保 持在氧化状态，呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质屮的染料被还原成无色。 实验步骤 匀浆:取lg肝细胞，剪碎，加9ml、0. 25ml/L缓冲蔗糖液匀浆（先加2nd匀浆，匀浆后再 加7ml）,双层尼龙布过滤于10ml试管屮备用。 差速离心:取lml 0. 34mol缓冲蔗糖液于2nd刻度离心管中（用滴管加至lml刻度即可）, 然后沿管壁小心加入肝匀浆,约0.5ml覆盖于上层,700 Xg （3000rpm）离心10分钟，弃 沉淀取上清液，lOOOOXg仃2000rpm）离心10分钟，沉淀为线粒体。 染色：取线粒体沉淀涂片（注意勿A浓密），不待干即加1滴1%儈纳斯绿B染色15min0 观察：盖上盖玻片，显微镜观察。（线粒体蓝绿色，呈小棒状或亚铃状。） 实验结果 线粒体蓝绿色,呈小棒状或亚铃: 线粒体蓝绿色, 呈小棒状或亚铃: 结果讨论 六.课堂小结 根据学生的实验结果进行总结。 如果使用不带冷冻控温的普通高速离心机操作，应尽量缩短操作时间、注意样品的冷冻,保持 其生理活性。