细胞生物学实验报告染色体的观察山东大学.docVIP

一、 实验名称 小鼠染色体标本的制备、观察 二、 实验目的 1、 熟悉动物牛殖细胞减数分裂过程及各个时期特点。 2、 掌握小鼠睾丸减数分裂标本的制作方法。 3、 学习染色体的染色和观察过程。 三、 实验原理 1＞染色体 染色体是细胞内具有遗传性质的遗传物质深度压缩形成的聚合体，易被 碱性染料染成深色，所以叫染色体（染色质）。染色体的分析往往是选择细胞处 于活跃增殖状态，或者经过各种处理后细胞进入分裂的动物组织。 2、 细胞分裂及其观察 细胞的有丝分裂可以大体分为五个阶段：前期、前中期、中期、后期、 末期，每一个时期都有它特定的形态和行为特征。 分裂前期：染色体凝集，间期细长、弥散分布的线性染色质，经过进一 步螺旋化、折叠和包装等过程，逐渐变短变粗，形成光镜下可辨的早期染色体结 构。随着染色质的凝集，核仁缩小消失。分裂极确立：复制了的中心体分离，向 两极移动。纺锤体装配：从中心体形成星体微管和极微管。 前中期：核膜崩解；纺锤体完成装配，前期星体的形成和向两极的运动 标志着纺锤体组装的开始。随着核膜的解体，由纺锤体两极发出的一些星体微管 可进入“核”内，通过其正极端捕获染色体，形成动粒微管。至此，纺锤体基本 完成组装；染色体整列，在动粒微管的作用下，染色体列队到赤道板。 中期：染色体排列在赤道板上，也是该实验的重点观察时期。 后期：姐妹染色单体分离并向细胞两极移动。后期A,动粒微管变短， 牵动染色体向两极运动；后期B,极微管长度增加，两极之间的距离逐渐拉长。 末期两子细胞核形成，染色体去浓缩，核膜重建，核仁重现。 在正常动物体内，骨髓和睾丸是处于不断分裂的组织。给动物注射一定 剂量的秋水仙素即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期，然后采用常规空气干燥 法制备染色体，即可得到大量可分析的染色体标本。在动物实验时，可在取材前 经腹腔注射有丝分裂抑制剂，一般常用秋水仙素，这此方法对于动物的核型分析 是非常有用的。本方法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌操作，易于推广。 因此睾丸和骨髓细胞是用于动物细胞遗传学研究很好的材料。 3、 睾丸 睾丸是雄性生殖细胞发育和成熟的部位，是产牛精子的器官。睾丸内的 曲细精管从外到内…次分布有精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细 胞以及形态渐变中的精子。取睾丸将曲细精管内的细胞冲岀后固定，然后制片染 色，可以观察到动物生殖细胞减数分裂染色体的不同时相。如果提前给动物腹腔 注射秋水仙素溶液，可以抑制牛殖细胞的正常分裂，增加中期分裂相细胞的数目， 此方法可用来进行减数分裂过程中染色体的计数与观察。 睾丸染色体标本的制备，可用來检测雄性个体生殖细胞是否受到周围环 境污染或是否发生病变，是小型动物生殖学常规实验。 4、 倒置染色法 在玻璃板上用废旧玻璃板作支架，使得标木载玻片的正面朝下放置到支 架上，在玻璃板和标木载玻片之间滴加Giemsa染液，这样，一可以节省染料， 二可以防止染料快速挥发，三可以防止染色颗粒沉淀影响观察。在操作时应注意, 多个样品同时染色应摆放紧密，不要有间隙。滴染液时应尽量慢，不要有气泡, 以免部分染色体不着色，影响观察。 三、 实验材料 1＞材料 6~8周龄，20~30g的雄性小鼠 2、 试剂 （1） 0.85%氯化钠溶液 （2） 0.02%秋水仙素溶液，4°C保存 （3） 0.4%KCI 溶液 （4） 卡诺氏固定液 无水乙醇：无水乙酸=3:1 （5） 1/15 mol/L 的磷酸缓冲液（pH二6.8） （6） Giemsa 染液 3、 器材 离心机、蹑子、解剖盘、载玻片、玻璃板、小烧杯、普通光学显微镜、 解剖剪、铜网、滴管、离心管等。 四、 实验步骤 染色体标本的制备： 1、 取雄性小鼠以每克体重4 U g注射秋水仙素，经14?16小时后，断头法 杀死小鼠，取出睾丸用生理盐水（0.9%的NaCI）洗去血污。 2、 放入装有lml 0.3%KCI液的小烧杯中剪碎，至溶液呈乳白色，使细胞分散。 用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3%KCI液至4ml。 3、 37°C静置30分钟，进行低渗处理。（整个过程控制在50分钟内）1000 r/min 离心8分钟。弃上清液，加入2ml甲醇?冰醋酸固定液（3： 1）,并用吸管至管底 吹气，轻轻打散细胞，固定8 Wo 4、 再以800?1000 r/min离心8分钟。弃上清液，加lml固定液，再制成 细胞悬液，固定5分钟。 5、 取洁净的低温预冷载玻片，距载片10?15cm高度滴下2?3滴细胞悬液 （使细胞分散），从载玻片一边向另一边轻轻吹气，并同时轻轻敲打载片，以使 细胞均匀分布和促使染色体展开。 6、 将玻片放置在标本盒中空气干燥。 1＞染色：倒置染色法用Giemsa液染色20?30分钟，细水冲洗玻片背面, 擦去多余染液，干燥。 2/镜检：低倍镜下