免疫荧光技术课件概要.ppt

2021/3/13 * 四、双重免疫荧光细胞化学标记方法 在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色,一般均采用直接法,将两种荧光抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合,加在标本上孵育后,按直接法用TMRITC或RB200标记或PE标记,发红色荧光,可以明确显示两种抗原的定位。 2021/3/13 * 在同一标本上有两种抗原需要同时显示(如A抗原和B抗原),A抗原的抗体用FITC标记,B抗原的抗体用罗达明标记,可采用以下染色方法: 1.一步法双染色方法 先将两种标记抗体按适当比例混合(A+B),按直接方法进行染色。 2.二步法双染色方法 先用RB200标记的B抗体染色,不必洗去,再用FITC标记的A抗体染色,按间接法进行。 结果:A抗原阳性荧光呈现绿色,B抗原阳性呈现橘红色荧光。 2021/3/13 * 五、对照试验 为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性,排除某些非特异性染色,必须在初次试验时进行以下对照试验: (一)直接方法(需设对照试验) 1.标本自发荧光对照 标本只加PBS或不加PBS,缓冲甘油封片,荧光显微镜观察应呈阴性荧光(无与特异性荧光相似的荧光)。 2021/3/13 * 2.抑制试验 可分为二步法和一步方法。 ①二步抑制方法:标本先加未标记的特异性抗体,水洗后再加标记荧光抗体,结果应呈阴性或明显减弱的荧光。 ②一步抑制方法:先将荧光抗体与未标记特异性抗体等量混合,再加在标本上染色,结果应为阴性,此法效果较二步法好,并且简便。 3.阳性对照 将已知阳性标本用直接法免疫荧光细胞化学染色,结果应呈阳性荧光。 2021/3/13 * (二)间接方法 1.自发荧光对照 同上。 2.荧光抗体对照 标本只加间接荧光抗体染色,结果阴性。 3.抑制试验 同上。 4.阳性对照 同上。 结果:如对照l和2无荧光或弱荧光,3待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。 2021/3/13 * (三)补体方法 1.自发荧光对照。 2.荧光抗体对照。 3.抑制试验。 乙补体对照 取新鲜豚鼠血清1:10稀释先作用标本,洗后再用抗补体荧光抗体染色,结果阴性。 5.抑制试验 标本加灭活的第一抗体,再加1:10稀释的新鲜豚鼠血清孵育后,再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释液,结果应为阴性。 6.阳性对照。 1—5结果阴性,6和待检标本阳性时,则为特异性荧光。 2021/3/13 * 第五节 非特异性染色 的消除方法 2021/3/13 * 一、非特异性染色的重要因素 组织的非特异性染色的机制很复杂,其产生的原因主要可分以下几点: (1)一部分荧光素未与蛋白质结合,形成了聚合物和衍化物,而不能被透析除去引起非特异性染色。 (2)抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白,可与组织成分非特异性结合。 2021/3/13 * (3)除去检查的抗原以外,组织中还可能存在类属抗原(如Forssman抗原),可与组织中特异性抗原以外的相应抗体结合。 (4)从组织中难以提纯抗原性物质,所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体,以致容易混淆。 (5)抗体分子上标记的荧光素分子太多,这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子,可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。 2021/3/13 * (6)荧光素不纯,标本固定不当等。 (7)组织或细胞内某些物质的自发荧光。 (8)染色时间过长,温度过高,冲洗不够甚至在染色过程中标本干燥等原因,都会引起非特异性荧光染色。 2021/3/13 * 二、消除非特异性染色的方法 应根据产生非特异性荧光的因素,采取相应的处理方法,常用有以下几种: l.衬染法 最常用0.1％～0.05％伊文斯蓝在荧光抗体染色后再染2—5s或用0.05％伊文斯蓝稀释抗体来抑制自发荧光。 将背景的细胞和组织染成红色,与黄绿色荧光形成鲜明对比。 2021/3/13 * 2.荧光抗体 在染色前用SephadexG—25或G-50(用微柱型)以除去游离或聚合的荧光素及未标记的蛋白。 3.胰蛋白酶消化 经常用0.1％—0.05％胰蛋白酶消化,对于石蜡切片不仅可以提高阳性率和阳性强度,而且可抑制非特异性免疫荧光染色。消化时间要根据组织类型,固定液的不同而选择消化时间,如肾穿标本0.05％胰蛋白酶消化2h最佳,而肝癌切片且