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读一文掌握 LncRNA 研究套路，打发诺奖揭晓的假期 今年诺奖揭晓，盆友圈已刷爆 ~ 大约是以下风格的 文 2017 年诺贝尔生理及医学奖，给了发现「生物钟」 机制的人在你熬夜修仙的时候，人家拿了关于熬夜的诺 奖 4 位科学家点评新科诺奖：节律，探寻生物体内的时 刻表好了，刷完盆友圈，小白们继续搬砖吧 假期抓紧时 间和赵老师一起多看文献。毕竟，树往上长，根往下扎。近 年来 lncRNA 的研究进展迅猛，各类 lncRNA 被大量发现， lncRNA 的研究将是 RNA 基因组研究领域非常热门的一个 方向。大星宝宝正好也在做 lncRNA 相关的课题，之前的沙 龙直播解读过一篇高分文献（点这里直达） ，今天继续总结 一下 lncRNA 的研究套路和最新研究进展。 LncRNA 基 本介绍 LncRNA ：long non-coding RNAs 是一类长度大于 200nt，但 不编码蛋白质的 RNAs ，广泛存在于动植物中。它们曾长期 被误认为是遗传暗物质，但近些年研究证实这类 RNAs 在生 物的生命活动过程中起着重要的调控作用。 特点 1. 长 度在 200-100,000nt2. 没有编码蛋白质潜能 3. 具有细胞或组织类型特异性 4. 表达量和保守性比 mRNA 低 5. 部分 lncRNA 不含有 polyA 尾巴 6. 部分也会翻译小肽段 LncRNA 功能及作用形式特点 1. 长度在 200-100,000nt2. 没有编码蛋白质潜 能 3. 具有细胞或组织类型特异性 4. 表达量和 保守性比 mRNA 低 5. 部分 lncRNA 不含有 polyA 尾 巴 6. 部分也会翻译小肽段 作用 1. Co-location ，也称 cis 作用 2. Co-expression, 也称 trans 作用 LncRNA 研究基本技术 1. 芯片或测序寻找新的 lncRNA2. 生物信息学分析 3. lncRNA 定位 4. 过表达或敲减功能验证 5. lncRNA 互作机制研究 LncRNA 的生物信息学分析 1. 基本处理 ? rRNA 比例评估 ? 基本比对统计，链 特异数据评估 ? Cufflink,stringtie 转录本组装 2. 特性 分析 ? 序列，位点保守性分析 ? 外显子个数 ,表达和长度分 析? 定量差异分析 3. 新 LncRNA 鉴定 ? 与已知 lncRNA 库比对过滤 ? 过滤 exonlt;gt;lt;gt;lt;gt;? CPC,CNCI,phyloCSF 编码潜能预测 ? ORF 长度过滤 ? miRNA 前体序列过滤 4. 功能分析 ? 顺和反式靶基 因预测 ? 靶基因功能富集分析 ? 共表达网络分析 LncRNA 表达验证 1. qRT-PCR 验证 ? cDNA 质量一定要高， 保证没有基因组 DNA 的污染 ? 按变化倍数排序，优先选择差异变化明显的 lncRNA? 按 FPKM 或 reads count 排序，优先选择表达量高 的 lncRNA2. Northern Blot? 既可以验证 lncRNA 的 表达丰度又可以验证序列信息，但精度不如 qRT-PCR3. cDNA 末端快速扩增 (RACE)? 确定 lncRNA 5 ’和 3’末端序列，进而获得 lncRNA 的全长信息 LncRNA 定位验证 FISH(Fluorescence in Situ Hybridization) 验证其亚细胞定位，因为其亚细胞定位与 lncRNA 的调控机制和功能相关。 对于已知 lncRNA 可以通过 RNALocate 数据库检索其亚细胞定位。 LncRNA 功能验证 功能获得构建 lncRNA 过表达载体，观察过表达 lncRNA 后对细胞增殖、凋亡、侵袭等影响。 2. 功能缺失根据其亚细胞定位选择合适的敲减方法。 有时发 现细胞的感染效率很高，但是 lncRNA 的干扰效率却很低。 因为 RNA 干扰作用只作用在胞浆内，细胞核中的 lncRNA 无法起作用，这时一般的 siRNA 或者 shRNA 方法可能不适 用。 3. 其他敲减方法： CRISPR/Cas9、反义寡核苷酸、位点 反转和启动子缺失等方法。非编码能力验证 构建含有肽段和 lncRNA 的质粒，验证其是否有编码能力。 LncRNA 互作验证 1.RIP （蛋白已知，RNA 未知）RIP（ RNA immunoprecipitation ） 又称为 RNA 结合蛋白免疫沉淀技术，相当于 RNA 的 ChIP 实验（染色质免疫沉淀） 。 目的： RIP 是研究 RNA 与蛋白相互作用的重要手段，利用 RIP 可以证明蛋白是否与 lncRNA