新型酪氨酸磷酸酶shp2抑制剂的合成、生物活性及分子动态模拟研究.docxVIP

新型酪氨酸磷酸酶 SHP2抑制剂的合成、生物活性及分子动态模 拟研究 目的 : 蛋白酪氨酸磷酸酶 SHP2是新的抗肿瘤药物研究靶点。 为寻 找新的具有较强抗肿瘤活性的 SHP2抑制剂 , 本课题以文献报道的 SHP2抑制剂 GS493,SHP836等为先导化合物 , 设计、合成了苯磺酸和 吡嗪胺两类新的衍生物 ; 测试了苯磺酸类衍生物对 SHP2蛋白活性中 心的抑制作用 ; 在细胞水平测试了所有化合物对人乳腺癌细胞 MDA-MB-231和非小细胞肺癌 NCI-H1975的增殖抑制活性 ; 选择活性较 好的化合物 Isubf/sub 、IIsube/sub 进行计算机辅助的分子 动力学研究 , 以探讨它们与 SHP2作用的具体模式及对 SHP2的选择性。 方法 :1. 目标化合物的设计与合成 : （1）保留 GS493的苯基腙吡唑啉 酮以及磺酸基团 , 用内脂环或酰胺代替 1 位苯环的硝基 ,3 位苯环的硝 基替换为氟、甲氧基等基团 , 设计了 12 个目标化合物 Isuba/sub-Isubl/sub 。其合成方法为 : 对硝基苯甲酸经酰氯化, 再与胺反应形成酰胺 , 然后再将其硝基还原 , 重氮化 , 还原 , 得到 N-取代 -4- 肼基苯甲酰胺中间体 ; 对氨基苯磺酸经过重氮化 , 与取代苯甲 酰乙酸乙酯耦合得到 4-{2-[1- 乙氧基 -3- （4- 取代） -1,3- 二氧代丙 -2- 基] 肼基 } 苯磺酸中间体 , 其再与 N-取代 -4- 肼基苯甲酰胺中间体反应得到目标产物 Isuba/sub-Isubl/sub 。（2）保留 SHP836,SHP099的吡嗪胺结构 ,3 位引入新的芳环或芳杂环替代二氯 苯环 ,6 位引入大位阻的取代哌嗪基团 , 设计了 12 个目标化合物 IIsuba/sub-IIsubl/sub 。其合成方法为 : 以 2- 氨基 -3- 溴-6- 氯吡嗪为起始原料 , 与取代硼酸发生 Suzuki 反应 , 得到 2- 氨基 -3- 取 代-6- 氯吡嗪中间体 , 其再与取代哌嗪发生亲核取代反应 , 得到目标产 物 IIsuba/sub-IIsubl/sub 。2. 目标化合物的生物活性评价 : 1）使用 SHP2试剂盒检测了化合物 Isuba/sub-Isubl/sub SHP2蛋白的抑制活性 ; （2）采用 MTT法检测了所有目标化合物对人乳腺癌细胞 MDA-MB-231和非小细胞肺癌 NCI-H1975细胞的增殖抑制活性 ; （3）活性较好的化合物 IIsube/sub 作用于细胞 NCI-H1975 48 h 后, 采用流式细胞术检测化合物对细胞凋亡影响。 3. 分子对接与动态模拟 : （1）使用分子对接与动态模拟软件探讨目标化 合物与蛋白的结合模式及强弱。 （2）使用 Autodock Vina 软件将所合 成的所有目标化合物与 SHP2及其同源蛋白 PTP1B,TCPTP,SHP1进行分子对接 , 结合分子动态模拟评价其选择性。 结果 :1. 本课题设计、 合成了 12 个 4- （2- 取代肼基）苯磺酸衍生物以和 12 个 3,6- 二取代吡嗪 -2- 胺衍生物 , 所有目标化合物通过 sup1/supH-NMR、sup13/supC-NMR、IR 和 MS进行了结构确证。 2.SHP2蛋白活性抑制实验表明 , 化合物 Isubf/sub 的活性较好 (ICsub50/sub=0.23 ±0.07 μM), 强于 PHPS1(ICsub50/sub=2.73±0.43 μM), 但是弱于 GS493(ICsub50/sub=0.18±0.02 μM);MTT法检测化合物抑制肿 瘤细胞增殖活性实验表明 , 在细胞 NCI-H1975上, 化合物 Isubf/sub(ICsub50/sub=3.38 ±1.85 μM)的活性优于 GS493(ICsub50/sub=20.92±1.23 μM)。化合物 IIsube/sub 、 IIsubi/sub 、IIsubk/sub 能够显著抑制非小细胞肺癌细胞 NCI-H1975细胞的增殖 , 其中化合物 IIsube/sub 、IIsubi/sub ICsub50/sub分别为 11.84 ±0.83 μM、10.30 ±0.69 μM,活性优于化合物 GS493(ICsub50/sub=19.08±1.01 μM)。流式细胞仪检测结果表明 , 化合物 IIsube/sub 对细胞 NCI-H1975存在促进其凋亡的作用 ; 在细胞 MDA-MB-231上, 化合物 Isubf/sub 在作用细胞 72 h 时, 其 ICsub50/sub值为 28.94 ±6.23 μM,活性强于 PHPS1(ICsub50/sub=30.