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白木香AsJAZI基因原核载体的构建与表达 沉香是我国传统中药，其味辛、苦，性微温，具行气止痛、 温中止呕、纳气平喘等功效。 白木香 Aq-uilaria sinensis （ Lour ） Gilg ，是我国生产沉香的唯一正品植物来源。 白木香是一种典型 的伤害诱导型药用植物， 其只有受到伤害才能产生沉香， 同时沉 香的产生也被认为是白木香树防御反应的产物。 沉香的化学成分 组成主要是倍半萜类和苯乙基色酮类衍生物质。沉香的应用广 泛，市场需求量大，长期以来处于供不应求的现状。因此，为了 提高白木香结香的产量， 揭示沉香形成的机制迫在眉睫， 且国内 外一些专家学者陆续开展了沉香结香机制的研究。但至今为止， 沉香结香的机制未得到很好的诠释。研究表明， TA在诱导白木 香结香的过程中扮演重要角色。 茉莉酸类物质（JAs）是植物内一种重要的植物激素，同时 也作为伤害信号分子激活相关转录因子的活性， 调节植物的防御 反应。TA信号途径中的抑制因子 JAZ （Jasmonate ZIM-domain， JAZ）蛋白（JAZs）是调节JA应答的关键因子。当植物未受到外 界胁迫时，体内的JA含量较低，JAZs阻抑相应的转录因子，如 MYC2 MYC3 MYC4等的活性，从而JA响应基因被抑制，不能启 动JA信号途径；植物一旦受到外界胁迫时， 体内的JA含量迅速 增加， JAZs 阻遏蛋白被 COI1 （coronatine-insensitive protein1 ）结合并通过SCFCOI1/26S蛋白酶体，经泛素化作用降 解，转录因子被释放，从而启动相应的 TA应答基因的转录。当 启动了 JA应答的同时，JAZs也被诱导，诱导表达的JAZs再次 抑制了转录因子的活性， 这种反馈调节的作用也正是避免植物体 产生过于猛烈的 JA 应答反应对本身的伤害。课题组前期转录组 测序结果表明AsJAZI基因是白木香响应外界伤害的过程中 JAZs 基因家族中表达丰度最高的一个基因响。 本实验首次报道了白木 香 As-JAZ1 基因原核表达载体的构建及表达， 为筛选互作蛋白因 子，研究基因功能及揭示 JA信号在沉香倍半萜形成中的作用机 制提供了材料基础。 材料 植物材料 中国医学科学院药用植物研究所温室栽培的 四年生白木香叶片。 菌种及载体 原核表达载体 oET-28a 保存于本实验室； 大肠杆菌TP010感受态、oGM-T连接试剂盒和Escherichia coli B121 （DE3购于天根生化科技（北京） XX公司。 1.3工具酶及主要试剂植物总RNA提取试剂盒、Fast HiFidelitv Polvmerase 高保真酶、T4连接酶和 2XTaq PCRMix 购于天根生化科技（北京）XX公司。限制性内切酶BamH和Xho I 购自日本 TaKaRa公司；RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit 购于 ThermoFisher SCIENTIFIC 公司；高纯度质 粒提取试剂盒购自于北京康为世纪生物科技 XX公司；IPTG,氨 苄青霉素（Amp，卡那霉素（Kan）和DNALadder Marker购自 于北京全式金XX公司。其他试剂均为国产分析纯试剂。本研究 所用引物由上海生工生物工程 XX公司合成，产物测序由英潍捷 基贸易XX公司完成。 方法 2.1白木香总RNA提取及cDNA的合成根据天根生化科技 (北京)XX公司的植物总RNA提取试剂盒说明书提取总 RNA禾I」 用1%琼脂糖电泳检测RNA的完整性和分光光度计 Nan oDrop2000 (Ther-no Scientific ，美国)测定 RNA浓度。利用 RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoFisher SCIENTIFIC公司)反转录成cDNA第一链，作为基因克隆的模 板。 AsJAZ1基因扩增 根据提交到 NCBI上的白木香 AsJAZ1 基因序列(KP677281)设计特异引物，上游引物加入 BamH I酶 切位点：5-CGGGATC-CATGGAGAGAGACTTrCTGGGT下游弓 I物 加入 Xho I 酶切位点： 5-CCGCTCGAGTCACTCAGCTrG-TATGGT，GC-3 加下划线部分即为引入的酶切序列。以白木香 cDNA为模板进行 PCFT增。PCR体系：快速高产聚合酶 0.5 u L, 5X快速高产PCR 缓冲液 5u L, dNTP Mixture (2.5mmol?L-1 ) 2卩 L,上下游引物 (10 u mol?L-1 ) 各 1 u L, cDNAl.Olu L, ddH2O14.5y L,终体 系为25 u L。PCR反应程序：94C预变性5mi