盐水致大鼠萎缩性胃炎胃粘膜组织细胞中hsp60及ras蛋白的表达.docxVIP

盐水致大鼠萎缩性胃炎胃粘膜组织细胞中HSP6 0及ras蛋白的表达 ras 与细胞内的信号传递、增殖、分化有关，在肠化、异型 增生的上皮中均有阳性表达， 参与多种肿瘤的形成与发展。 热休 克蛋白（HSP与细胞的转化和恶变过程密切相关 [1]，HSP通 过调控细胞周期所必需的蛋白构象参与细胞的增殖和死亡过程。 本研究利用激光扫描共聚焦显微镜 （ laser scanning confocal microscope，LSCM）的高分辨性及同屏显示不同发射波长荧光色 的特性，观察上述两种蛋白在大鼠萎缩性胃炎胃粘膜组织细胞中 的表达情况。 材料与方法 材料 7周龄健康、性成熟的雄性 SD大鼠（由第四军医动物实验 中心提供）64只，体质量200g?250g，按随机化原则分为3组， 即正常喂养组、正常对照组和盐水组。每组各 20 只。采用架式 笼养，恒温（24 ± 1）C，湿度 50%- 60% 方法 1.2.1 大鼠萎缩性胃炎模型的制作 正常喂养组为正常喂养，饮白开水；正常对照组为 25C白 开水灌胃，每次2.5mL, 1次#8226;d-1 ;盐水组为15縊水灌 胃，每次2.5mL, 1次#8226;d-1。实验开始，先处死 4只正常 组大鼠， 并留取胃大体标本作为对照。 以后各组分别于 8W、12W、 24W 32W 65W各随机取4只，以观察粘膜萎缩情况，具体方法 参见文献 [2] 。 按身体质量与给药容积比值为 0.5%腹腔注射戊巴比妥麻醉， 取出鼠胃，沿大弯剪开作大体观察，包括粘膜的色泽、弹性、皱 襞多少、粘液是否丰富。沿大鼠胃小弯条状取材，包括胃窦及部 分胃体，做病理切片，HE染色后进行组织学观察。参照 1994年 美国休斯顿胃炎诊断分类标准 [3] 及 2000年国内井冈山胃炎诊 断分类标准， 对粘膜厚度、 胃小凹颈部粘膜宽度及细胞厚度进行 测量。组织切片由专人采取盲法阅片。统计学方法采用 t 检验。 免疫荧光及激光扫描共聚焦显微镜检测技术 按身体质量与给药容积比值为 0.5%腹腔注射戊巴比妥麻醉， 取出鼠胃，沿大鼠胃小弯条状取材，包括胃窦及部分胃体，做组 织切片。 胃黏膜组织HSP60和ras蛋白表达采用激光共聚焦免疫荧光 双标方法。所需仪器（荧光显微镜、恒温箱、荧光分光光度仪、 电镜、共焦镜等）由第四军医大学提供，免疫荧光双标记检测试 剂盒由武汉博士德公司提供。 具体步骤：①将组织切片在二甲苯中浸 3次，每次10min ； 脱蜡后切片依次浸入 1000 ml#8226;L-1 、950 ml#8226;L-1 、 700ml#8226;L-1梯度乙醇中脱二甲苯， 每次2min；至蒸馏水中 浸 5 min，0.01mol#8226;L-1 的 PBS振洗 3 次，每次 5 min ； 正常山羊血清封闭，37C, 30 min ;②分别滴加50mol/L的1 : 1 混合的兔抗大鼠 ras （1 ：100）和小鼠抗大鼠 HSP60（1：200） ， 设空白对照（无一抗，加 PBS和抗体特异性对照（加一抗不加 二抗，加二抗不加一抗） ，所有切片同时染色。 切片一抗加入后， 置于湿盒内，4C,过夜；③取出后 37C复温60 min , O.OImol#8226; L-1的PBS振洗3次，每次5 min;免疫荧光双 标记分别滴加 50mol/L 的 1 ： 1 混合的 FITC 标记的羊抗小鼠 IgG 和罗丹明标记羊抗兔 IgG, 37C, 40 min ; 0.01mol#8226; L-1 的PBS振洗3次，每次5 min ; 10%的缓冲甘油封片；④激光扫 描共聚焦显微镜观察所用 LSCM勺型号为MRC-1024装有Zeis100 显微镜，用于FITC的激发波长为488nm, 568nm用于激发Texas Red,用于图像采集的显微镜物镜为 Plan-Neofluar 40x油浸镜， 数值孔径（NA为1.3，图像存为512X512像素类型，焦距值 设为 1.0 ,若需要更大的放大倍数时,可以选择更大的焦距值范 围,扫描所用的激光值依据样本不同可以在共聚焦系统提供的梯 值中选择。 结果 光镜结果显示,正常对照组于灌胃 8, 12, 32 wk 时黏膜表 面光滑,无糜烂,固有层无炎细胞浸润,黏膜下层无水肿,肌层 无炎细胞浸润。正常对照组于灌胃 65 wk 时可见黏膜肌层平滑肌 轻度增生,呈钉突状向黏膜肌层插入,黏膜出现轻度萎缩改变。 盐水组于盐水灌胃后第 24wk大鼠胃黏膜出现腺体明显缩小，黏 膜肌层的平滑肌呈束状增生插入黏膜固有层中 . 腺体上 1/3 至 2/3 腺上皮萎缩，腺管腔增宽，胃小凹颈部黏膜宽度变窄， 第 32wk 时大鼠胃黏膜萎缩更加明显（图 1）。激光共聚焦显微镜观察显 示：正常组胃粘膜组织细胞未见阳性表达，