小鼠脑内兴奋性氨基酸的体外微透析法测定(精).docxVIP

小鼠脑内兴奋性氨基酸的体外微透析法 测定* 團 在动物缺血缺氧性脑损伤的研究中，有关脑内兴奋性氨基酸毒性的研 究近年来取得了很大进展。许多证据表明，缺血缺氧可导致动物脑内兴奋性氨 基酸持续升高，细胞膜上离子通道病理性开放，细胞内 超载，最后造成急 性期神经元水肿和退变［1,刀。因此，对脑内兴奋性氨基酸含量的测定已成为目 前研究缺血缺氧性脑损伤及内源性保护机制的重要手段之一。为了深入研究缺 血缺氧性脑损伤的机制，以及内源性的缺血缺氧耐受机制，我们建立了小鼠脑 内兴奋性氨基酸的体外微透析-高效液相色谱（high performanee liquid chromatograph, HPLC）快速测定方法，并应用于急性重复缺氧小鼠研究中。 材料与方法 （一） 仪器：1050 A型液相色谱仪，美国惠普公司（Hewllet-Packard）产 品。WZS-5Q型微量注射机（灵敏度：土 5卩L/h）浙江医科大学医疗器械厂产 品。 （二） 试剂：氨基酸标准品、邻苯二甲醛（o-phthaldialdehyde, OPA）、硼酸 为美国Sigma公司产品，巯基乙醇、甲醇、无水乙酸钠等均为国产分析纯试 剂。 （三） 样品制备：1.急性重复缺氧动物样品的制备：将昆明小鼠（体重 16.00?22.00 g）置于含有新鲜空气，经过标定的125 mL广口瓶中，以橡皮塞 密闭，一出现喘呼吸立即取出，并随即转移到另一相似体积的、含有新鲜空气 的广口瓶中，密闭。如此重复1次或4次后立即断头，将鼠头迅速置于液氮罐 中，隔夜取出。冰浴条件下取脑组织约 400 mg,加入冰冷的超纯水1.5 mL，匀 浆。匀浆液立即置于4C保存，4 h内透析。2.空白对照样品的制备：空白对照 组动物除不经缺氧处理外其它处理同缺氧组。 （四） 微透析实验：1.微透析探头：选用瑞典 Camegie Medicine公司生产的 CMA/10型同心圆微透析探头，透析膜长 4 mm,外直径0.5 mm。2.透析探头体外 回收率的测定：将透析探头分别置于不同浓度的氨基酸标准混合液中，用微注 射机以1.0卩L/min速度向探头内灌流生理盐水，在 0?4C条件下收集透析 液，用HPLC法测定透析液中谷氨酸（glutamate, Glu） 与天门冬氨酸（aspartate, Asp）含量，观察探头外氨基酸浓度对探头回收率的影响。 3.样品的微量透析： 制备好的小鼠脑匀浆液样品置于冰盒内，透析探头置于样品中，以 1.0 卩L/min速度连续灌流生理盐水，在 0?4 °C条件下收集到的透析液立即置于 4C保存。 （五） 样品的HPLC法测定：1.氨基酸标准液和衍生化试剂的配制：用 0.5 mol/L盐酸溶液配制含22种氨基酸的标准溶液，4C保存。衍生化试剂：10 mg OPA溶于0.25 mL甲醇中，再加入 20卩L B -巯基乙醇和2 mL 0.2 mol/L 硼酸 缓冲液(pH 9.5)混匀，4C保存，24 h后使用。每隔1 d补加10卩L B -巯基 乙醇，1星期内使用。2.色谱条件及衍生化反应：柱：Nova Pak C18色谱柱 (Waters) ， 150 mnX 3.9 mm i.d., 粒径 4 卩 m,柱温：40°C，流速：0.8 mL/min,流动相组成：A液为0.1 mol/L，乙酸钠缓冲液(pH 6.95)内含8%甲 醇；B液为甲醇。样品采用自动进样器自动进样，进样程序及衍生化反应为： (1)洗针，(2)吸取OPA 20卩L，(3)吸取样品20卩L，⑷混和20次(时间60 s)，(5)进样40卩L。样品采用下述梯度洗脱程序快速洗脱：0?7 min,100% A 液；7?9 min，100% B液；9?10 min，100% A液。荧光检测器激发波长 360 nm,发射波长455 nm处检测样品中Glu与Asp的含量并以外标法定量。 结果 微透析探头的体外回收率：以1.0卩L/min速度灌流微透析探头，随 着氨基酸标准混合液浓度的增高，探头回收率逐渐降低，在 0.01?10.00 mmol/L的溶液中，回收率可达 30.0%(Glu)和33.4%(Asp)。 HPLC色谱：用本研究的HPLC法测定标准氨基酸混和液中 Glu与Asp 的含量，得到的色谱如1所示。 线性范围与最小检测浓度：用HPLC法测定氨基酸标准混合液，以测得 的Glu与Asp峰面积为纵坐标，含量为横坐标绘制工作曲线，两种物质的线性 范围在0.01?10.00 mmol/L之间，相关系数分别为 Glu : r=0.996,Asp : r =0.995,最小检测浓度达 0.001 mmol/L。 IP Fig 1 Chromatograms of an ami no acid sta ndard mixture 1氨基酸