和在细胞中对慢性感染和基因表达的作用.docxVIP

摘要3．流式细胞术检测转染效果 摘要 3．流式细胞术检测转染效果 转染24h后，用胰酶消化各组细胞，PBS清洗3次，用加样枪轻轻吹匀后上 机检测，激发波长为480nm，检测波长为620nm，设空白组为对照孔。 4．miR-21和miR一132 qPCR相对定量检测 转染24h后，收集各组细胞，提取总RNA，以1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整 性。以总RNA为模板，设计针对miR一21、miR一132成熟序列的特异性RT—PCR茎环 引物(由广州锐博生物公司设计合成)，逆转录后进行qPCR，以u6为内参。采用 多州“相对定量分析方法检测各组miR一21、miR-132的相对表达量。 5．化学发光法检测培养液上清HBsAg和HBeAg 取转染后24h、48h、72h各组细胞培养上清液(阳性对照组除外)，1500rpm 离心5min，吸取上清，用化学发光免疫分析仪进行检测。 6．培养液HBV DNA拷贝数检测 收集转染后24h、48h、72h各组细胞培养上清液(阳性对照组除外)，1500rpm 离心5min，按试剂盒操作处理样品，用定量PCR仪检测。每管设2个复孔。 7．c—myc基因mRNA水平的RT-PCR检测 以总RNA为模板，逆转录成cDNA，以此为模板进行PCR扩增。上游引物为 CGTCCTCGGATTCTCTGCTC，下游引物为GCTGGTGCATTTTCGGTTGT。内参为GAPDH，上游 引物为：GCTCTCTGCTCCTCCTGT，下游引物为：ATGAGTCCTTCCACGATAC。PCR产物进 行2％琼脂糖凝胶电泳后进行灰度值分析。 8．PTEN基因mRNA水平的RT—PCR检测 以总RNA为模板，逆转录成eDNA，以此为模板进行PCR扩增。PTEN上游引物 为：GGGGTGGAACTGTGCACTAA，下游引物为TAGGCTTTGAAGGACAGCAGG。内参为GAPDH， 引物同前述。反应结束后PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳和灰度值分析。 9．c—myc／PTEN基因蛋白水平的western blot检测 在转染72小时后提取各组细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度并调节各组蛋白样 品浓度至相等，变性后进行SDS—PAGE电泳，半干转至PVDF膜，以浓度为l：1 500 的一抗4℃过夜封闭、l：2000的二抗37。C封闭1小时，TBST洗膜后滴加ECL发光 液显影，用灰度值分析条带，计算各组c-myc／PTEN基因的相对表达量。内参为 D-actin。 万方数据 硕士学位论文10．CCK-8检测细胞增殖 硕士学位论文 10．CCK-8检测细胞增殖 取转染24h后各组细胞，胰酶消化后接种到96孔板中，每孑L 1000个细胞，培 养液200ul，每组接种4孔，分别于1至4天检测细胞增殖情况。检测时每孔加 CCK一8试剂20ul，培养1．5小时后用酶标仪检测各孔450nm吸光值，绘制生长曲线 图。每组设三个复孔，所有实验重复3次。 11．统计分析 所有数据描述为均数±标准差，用SPSS 20．0软件进行统计学分析，取 尸m 05为有效检验值，两组间采用t检验，多组问采用单因素方差分析。 结果 1．重组质粒验证 菌落PCR产物电泳后可见条带与插入片段大小一致；重组质粒经EcoR I和 BamH I双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳可见质粒大片段和插入的基因小片段两条 条带，其中pmR一21重组载体小片段位于300bp与500bp之间，pmR一132重组载 体小片段位于500bp与750bp之间，分别与pre—miR一21、pre—miR一132的PCR 产物大小一致。最终测序证实pre—miR一21、pre—miR一132基因片段已经插入 pmR—mCherry质粒中，pmR一21和pmR一132重组载体构建成功。 2．转染24小时后荧光显微镜下观察载体荧光蛋白表达效果 镜下观察各组细胞形态正常，pmR一21和pmR一132重组载体组、空载体组观察 到红色荧光。流式细胞术检测转染效率大于50％。空白组无荧光。 3．qPCR检测miR一21相对表达量 以空白组为1，转染24h后，pmR一21重组载体组HepG2．2．15细胞中miR一21 的相对表达量(18．88±2．35)高于空载体组(1．01±0．11)，PO．01。空载体组 和空白组无差异。 4．qPCR检测miR一132相对表达量 以空白组为1，转染24h后，pmR一132重组载体组HepG2．2．15细胞中miR一21 的相对表达量(20．10±2．29)高于空载体组(0．97±0．11)，PO．01。空载体组 和空白组无差异。 5．转染24h、48h、72h细胞培养液上清HBsAg币HHBeAg检测 V 万方数据 摘要pmR一21组转染24h、4