和双特异基因修饰细胞及其活性.docxVIP

博士学位论文 博士学位论文 胞进行基因修饰尚未见报道。 有研究者提出，在人初始T细胞池中，不同特异性的TCR种类108，而潜 在外源肽1015，因此，TCR的数量与大量潜在的外源肽．MHC复合物相比，是 相形见绌的。适应性T细胞免疫要求每个T细胞都能识别大量与细胞异常相关 的潜在抗原肽，这种现象可以由T细胞的交叉反应性来解释。最近报道的从I 型糖尿病患者分离的1E6 TCR具有非常大的交叉反应性。表达1E6 TCR的T 细胞除了识别前胰岛素原来源的HLA．A*0201限制性PPll5_24肽 (AI WGPDPAAA)以外，还至少对130万个十肽产生反应，反应强度与PPIl5-24 一样强烈。在这些大量肽中，活化表达IE6 TCR的T细胞时，RQFGPDFPTI 比PPIl5．24的活性强100倍以上，尽管它与PPIl5-24在组成上有七个氨基酸不一 致。因此，我们完全有理由相信可以找到一个单一TCR同时识别两种抗原肽。 本文首次提出通过转导一个TCR同时产生针对两种不相似病原体抗原肽 的活性反应，为MTB／HIV共感染患者的免疫治疗提供新的思路。利用分别负 载MTB肽A9858199-207(KLVANNTRL)和HIV-1肽Envl20．128(KLTPLCVTL) 的树突状细胞(dendritic cell．DC)反复刺激HLA—A木0201型健康人外周血CD8+ T细胞，通过互补决定区3(complementarity determining region 3，CDR3)谱型 分析，筛选出同时对A9858199-207和Envl20．128特异的单一TCR，通过逆转录病 毒载体将双特异TCR基因转导至普通CD8+T细胞中使其表达。研究结果显示， 双特异TCR基因修饰的CD8+T细胞既可针对A9858199_207产生高水平的IFN-y、 TNF．a和GrB分泌及特异性杀伤，同时也可针对Envl20．128产生显著的效应反应。 本研究为MTB／HIV共感染过继细胞免疫治疗奠定了基础，同时也为其他共感 染疾病的免疫治疗研究提供了模式和平台。 方法 1．筛选A9858199-207和Envl20．128双特异TCR 1)采用淋巴细胞分离液分离HLA—A*0201型健康志愿者外周血单个核细胞 III 万方数据 中文摘要(peripheral 中文摘要 (peripheral blood mononuclear cell，PBMC)； 2)PBMC贴壁培养2 h后，吸出悬浮细胞，往贴壁细胞中加入100 ng／mL重组 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor,rhGM-CSF)和1 00 ng／mL重组人白细 胞介素一4(recombinant human intedeukin-4，rhlL-4)诱导DC； 3)MTB肽A9858199．207(50 1．tg／mL)和HIV-1肽Envl20．128(50 lag／mL)分别冲 击致敏DC； 4)利用分别负载A9858199-207和Envl20．128抗原肽的DC诱导抗原特异T细胞发 生克隆扩增： 5)经过两轮刺激后，磁珠分选CD8+T细胞，提取mRNA，逆转录为cDNA； 6)CDR3谱型分析检测刺激前后CDR3谱型，找出刺激后均呈单克隆增生的 A985B a99．207和Envl20-128双特异的TCR a、D基因家族。 2．重组逆转录病毒载体构建与病毒滴度测定 1)根据NCBI网站GeneBank报道的人TCR(It、D基因家族上游可变区(variable region，V)和下游恒定区(constant region，C)基因序列，设计TCR a和B 链全长基因上、下游引物，扩增出A9858199-207和Envl2m128双特异的c【17和B15 基因； 2)根据文献报道的影响外源TCR基因表达和功能的C区9个关键氨基酸序列。分 别设计Ⅱ和B链C区突变位点上、下游引物，利用重组PCR方法将TCR 0【、p链 C区9个关键氨基酸进行替换； 3)利用重组PCR技术，将TCR 0【和p基因通过自剪切多肽P2A连接，测序鉴定正 确后插入逆转录病毒载体pMX．IRES．GFP，酶切鉴定； 41采用脂质体转染法， 将重组逆转录病毒表达载体 pMX．B15．P2A．a17．IRES—GFP与包膜蛋白质粒VSV—G共转染GP2—293包装细 胞； 51收集转染后48 h病毒上清，低温超速离心浓缩纯化重组病毒，分装后保存于 IV 万方数据 博士学位论文-80。C； 博士学位论文 -80。C； 6)重组病毒感染NIH3T3细胞，流式细胞术检测其感染性滴度，计