主要结构蛋白原核表达及其抗体检测试剂盒的研发.docxVIP

IUl IUl I II III II I II IIII U Y3088049 广西大学学位论文原创性和使用授权声明 本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得 的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大 学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研 究工作所做的贡献均己在论文中作了明确说明。 本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归 属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有 权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 本学位论文属于： 口保密，在 年解密后适用授权。 口不保密。 (请在以上相应方框内打“√”) 论文作者签名：划踌 日期：20l(7年b同8目 指导教师签名：二≥至7夕—勿期 20 l b缉6同8日 作者联系电话：’肟7-71，，Io@o 电子邮箱： 引D弓2手6≥岁⑨?侈．∞h 万方数据 IBDV主要结构蛋白VP2、VPl原核表达 IBDV主要结构蛋白VP2、VPl原核表达 及其ELISA抗体检测试剂盒的研发 摘要 传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病 病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一种急性、高度接触性 疾病，除了直接导致临床发病之外，还可引起感染鸡的免疫抑制，使机体 对其他病原体的易感性增加，继发感染其他病原，给养殖业造成了巨大的 经济损失。间接ELISA是目前检测IBDV抗体方法中应用最广泛的血清学 方法，具有特异性强和敏感性高的特点，且易操作、设备简单。本课题使 用原核表达系统表达了IBDV的主要结构基因，并以VP2、VPl和VP2．VPl 三个重组蛋白作为包被抗原建立了相应的间接ELISA方法，期望为生产上 IBDV抗体的检测、基因工程疫苗的研发提供一种可靠的检测手段。 首先利用PCR技术扩增了IBDV分离株NNll72的VP2和VPl基因， 预测并筛选了VP2和VPl基因中抗原性、表位可能性和亲水性较好的重要 区段，通过同尾酶法获得VP2．VPl串联基因；然后把3个基因的扩增产物 分别连接到原核表达载体pET-32a，构建了zSVP2．pET、AVPl。pET和厶 VP2．VPI-pET三个重组体，测序验证后把重组质粒转入大肠杆菌BL21，经 IPTG诱导优化表达，表达产物经SDS．PAGE分析，证实得到分子量分别为 69 kDa、114 kDa和63 kDa的VP2、VPl和VP2．VPl重组蛋白；经粗纯化 及Ni．NTA亲和层析纯化后获得纯度较高的重组蛋白；Westem blotting分析 表明，VP2、VPl、和VP2．VPl重组蛋白均可与IBDV的特异性抗体发生反 应，说明重组蛋白具有良好的反应原性。 以纯化的VP2、VPl和VP2．VPl重组蛋白作为包被抗原，建立了相应 的间接ELISA抗体检测试剂盒即VP2．ELISA、VPl．ELISA和 VP2一VPl一ELISA。分别检测IBV、ReoV、ALV和NDV阳性血清，结果均 为阴性，表明建立的间接ELISA具有高度的特异性；进行重复性试验，批 万方数据 内变异系数在2．2‰6．9％之间，批间变异系数在2．8％～14％之间，表明建立 内变异系数在2．2‰6．9％之间，批间变异系数在2．8％～14％之间，表明建立 的方法具有良好的重复性；应用建立的间接ELISA检测分别免疫了IBD灭 活疫苗、IBD基因工程疫苗和IBD弱毒疫苗的商业鸡场的免疫血清共570 份，结果能显示疫苗免疫后机体抗体水平的变化趋势；用建立的间接ELISA 以及商品试剂盒A、B平行检测OD450在间接ELISA临界值附近的184份 血清样品，结果显示，与商品试剂盒A相比，VP2．ELISA的相对敏感性、 相对特异性、符合率分别为91．5％、93．3％、92．4％，VPl．ELISA的分别为 86．2％、91．1％、88．6％，VP2．VPl．ELISA的分别为89．4％、92．2％、90．8％。 与商品试剂盒B相比，VP2．ELISA的相对敏感性、相对特异性、符合率分 别为92．6％、95．5％、94％，VPl．EUSA的分别为87．3％、93．2％、90．2％， VP2．VPl．ELISA的分别为90．5％、94．3％、92．3％。 本课题的研究结果表明，应用重组表达的IBDV主要结构蛋白研发的 间接E