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病毒宏基因组学概述及其应用 研究背景 宏基因组学简介 病毒宏基因组学 研究策略与技术路线 研究成果与前景展望 Here We Go！ * 一大难题 virus A virus B virus C BACTERIA virus D 在人类生产生活中，致病的微生物众多，其中病毒性疾病占据大多数，而现有的诊断方法不可能囊括所有的病毒。因此，从宏观上把握致病性病毒的潜在数量种类以及致病机理变得尤为重要。 * 案例1： Electron micrographs of the human fecal sample. (a) Rod-shaped particles negatively stained with potassium phosphotungstate in 2003. (b) Icosahedral (open arrows)and short rod-shaped particles (filled arrow) recently stained with ammonium molybdate, from the second fraction of the sucrose gradient. Scale bars = 50 nm. 2013年6月巴西圣保罗阿道夫?鲁茨研究所的西尔瓦娜等人利用病毒宏基因组学对人面部潜在微生物进行研究。 案例2： 2002年Breitbart应用鸟枪测序法（shotgun sequencing）首次对美国加州海岸的2处海洋中病毒群体进行研究，发现374-7114个潜在的新病毒。遗憾的是无法对其进行归类。 两个案例 病毒宏基因组学何以横空出世 四大瓶颈 很多病毒缺乏特异的细胞系或者生长过程中观察不到细胞病变(CPE)。 用电镜来观察病毒其灵敏性相对较低。 血清学反应，高效的特异性抗体很难获得，有的出现交叉反应而影响结果。 　　PCR法必须基于基因序列，对于未知序列的病 毒和变异性大的病毒此法难以实施。 宏基因组学 　 宏基因组学研究的对象是特定环境下所有生物遗传物质的总和，它包含了可培养的和不可培养的微生物的基因总和。研究热点：细菌和病毒宏基因组学。 宏基因组学(Metagenomics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体, 自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系。 宏基因组学(Metagenomics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体, 自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系。 * 病毒宏基因组学 病毒宏基因组学：宏基因组学的一分支，指研究特定环境中的病毒群落一门学科。 应用 解释未知病因 挖掘新的活性物质 分析特定环境中的病毒群落 发掘潜在的新的病毒性疾病 病毒宏基因组学 2005年,Edwards首次提到病毒宏基因组学这一概念，其描述的是环境中的病毒群落—噬菌体。 2007 年, Delwart 再次提到病毒宏基因组学这一概念,并对宏基因组学挖掘新病毒的方法进行了阐述； 该文侧重于人和动物机体中的真核病毒群落。 最早应用宏基因组学理论分析病毒群落的科学家是Breitbart教授，他于2002年应用鸟枪测序法（shotgun sequencing）首次对美国加州海岸的2处海洋中病毒群体进行研究，发现374-7114个潜在的新病毒。 2006年，Zhang等应用宏基因组学在人的粪便中发现了大量的植物病毒。 2010 年，Li 等分析了蝙蝠粪便中的病毒群落。该研究发现了大量新的哺乳动物病毒和昆虫病毒。 * 研究策略与技术路线 样品的处理 遗传物质的分离与富集 构建文库 宏基因组学文库的筛选 序列分析 * 研究策略与技术路线 解冻 稀释 离心 过滤 消化 样品的处理 VIS:Very Important Step * 研究策略与技术路线 PCR 产物的纯化 PCR 扩增 反转录 双链 cDNA 合成 DNA RNA 遗传物质的分离与富集 * 研究策略与技术路线 文库的构建 基因组 文库 部分基因 文库 基因组cDNA文库：cDNA文库中的外源DNA片段，是互补DNA。cDNA是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的双链cDNA 。 基因组DNA文库：将生物体的全部基因组用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度的DNA片段，与合适载体体外转化至宿主细胞所获得的阳性菌落。 基因文库：某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外通过重组后，转化至宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体),所有的菌落或噬菌体的集合。 * 基因组文 库和部分 基因文库 的关系 文库的构建 * 研究策略与技术路线 文 库 的 构 建 根据宏基因组学文库筛选方法和研究目的的不同，构