核酸分子杂交.pptxVIP

核酸分子杂交;定义;种类;DNA Hybridization;一. 核酸探针制备及标记;探针;(一)缺口平移标记法（Nick translation）;标记;标记;标记;操作步骤;操作步骤;操作步骤;（二）5′末端标记法;［试剂］;操作步骤;4. 分离：加等体积饱和酚，离心5 ~ 10分钟后，取上清液到另一个小离心管内，再加500μl乙醚，混匀，离心，弃去上层含有残留酚溶液，加 1/10体积 3.0mol/L醋酸钠。然后加双倍体积冷乙醇混合在-70℃中15分钟，或-20℃中2小时，沉淀DNA。 ;（三）随机引物标记法;［原理］;操作步骤; 3. 冰浴中在一微量离心管中依次加入下列试剂并混匀： 10× Klenow 缓冲液 2.5μl 10× dNTP 2.5μl Klenow 片段 1.0μl [α-32P]dCTP 5.0μl 4. 将上述混合液加入到变性模板DNA随机引物溶液中。 5．室温放置3小时以上。 ;6．加1μl 0 .5mol/L EDTA（pH8.0)终止反应，并用TE缓冲液稀释反应液至100μl，—20℃保存备用。 ;（四）光化生物素法;;操作步骤;3. 加1/10体积3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2倍体积冷无水乙醇，混匀后置—20℃过夜。 4. 离心的沉淀经干燥后，溶于适量的0.1mol/L EDTA或灭菌双蒸水中，浓度为50μg/ml，分装后—20℃避光保存。 ;（五）DIG标记探针;二. 斑点杂交;材料;2. 试剂;⑶硫酸葡聚糖（1mg/ml）：称取1mg硫酸葡聚糖干粉，溶于1ml灭菌水，—20℃保存。 ⑷50×Denhardt溶液（1%BSA、1% PVP-40、1% Ficoll-400）：分别称取1g BSA， 1g PVP-40（聚乙烯吡咯烷酮），1g Ficoll-400（水溶性聚蔗糖），用少量双蒸水溶解混合，加双蒸水至100ml。过滤除菌，—20℃保存。 ;⑸变性鲑鱼精DNA（10mg/ml）：称取鲑鱼精DNA（Sigma，Ⅲ型，钠盐）10mg放入灭菌管中，加入100mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA缓冲液1ml，用超声波处理至液体透亮，完全溶解，分装后—20℃保存。临用前置沸水浴中3分钟，然后迅速在冰浴中冷却。预杂交液中应含100μg/ml DNA经变性并打断的鲑鱼精DNA。 ⑹卵白素-碱性磷酸酶（Avidin-AKP，100U/100μl）：以0.4% Triton X-100 PBS液配制。使用液中Avidin-AKP浓度为 1~2U/1ml。 ;⑺底物缓冲液：100mmol/L Tris-Cl（pH9.5）、1mol/L NaCl、5mmol/L MgCL2。 ⑻底物显色液 1）50mg/ml BCIP： 10mgBCIP溶于 200μl二甲基酰胺。 2）75mg/ml NBT：15mg NBT溶于200 μl 70%二甲基酰胺（H2O配制）。 3）底物显色液： 5ml 底物缓冲液 + 10μl BCIP + 10μl NBT ;操作步骤;2）RNA样品：在 Eppendorf 管加入下列试剂： RNA样品 10 μl 20× SSC 2 μl 甲醛 7 μl 甲酰胺 20 μl 混匀置68 ℃温育15分钟，并迅速入冰浴中至少5分钟。 ;(2) 尼龙膜的预处理：戴上干净手套，取尼龙膜按需要剪成合适大小，并剪掉一角作为点样顺序标记。如采用手工点样，用铅笔在尼龙膜上按0.8 ~ 1cm2的面积标上小格。用蒸馏水浸湿，再浸入6×SSC溶液中至少30分钟，将膜取出自然凉干后待用。 ;(3)点样;点样;点样;点样;点样;2. 预杂交;3. 杂交;杂交;4. 洗膜;洗膜;洗膜;5. 放射性自显影;6. 结果观察;（二）光敏生物素标记DNA探针的点杂交;3. 杂交;杂交;杂交;4. 洗膜;5. 显色;显色;6. 结果判定;三. Sourthern印迹杂交;;材料;;操作步骤;;;;;;;;;;;;;;;;;Diagnosis of Sickle-Cell Anemia;四. Northern印迹杂交技术;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;五. 原位杂交;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;点样;4. 洗膜;5. 显色;;;;;