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最新资料推荐 最新资料推荐 PAGE PAGE # / 8 最新资料推荐 PAGE PAGE # / 8 实验四电镜切片制作与观察 实验四 电镜切片制作与观察 实验目的 了解扫描电 镜生物样品的常规制备技术，重点掌握样品的表面处理方法，临界点 干燥仪和离子溅射仪的结构与工作原理。 了解生物样品超薄切片的一般制备技术， 重点掌握包埋与聚 合、玻璃刀的制作、修块、铜网及其支持膜、切片厚度判断等。 了解H-7000透射电镜的结构及其工作原理，重点是镜筒系 统。 实验原理 1 、电子束的特点 穿透能力有限，不超 过 100nm。 、电子成像机制 电子成像的反差主要源于样品散射电 子能力的 差异。 、生物样品的特点 含水量高、质地柔软、对热和电子 束敏感，散射 电子的能力弱且差异小。 、扫描电镜及常规扫描电镜生物样品制备技术 (1) 扫描电镜 扫描电镜是一种利用电子束扫描样品表面从而 获得样品信息的电子显微镜。 扫描电镜由三大部分组成： 真空系统，电子束系统以及成像系统。 (2)扫描电镜样品制备要求 扫描电镜以观察样品的表 面形态为主。 扫描电镜样品的制备，必须满足以下要求: 保持完好的组织和细胞形态；充分暴露欲观察的部位；良好的导 电性和较高的二次电子产额；保持充分干燥的状态。 （3）扫描电镜样品制备流程 某些含水量低且不易变形 的生物材料，可以不经固定和干燥而在较低加速电压下直接观察， 如 动物毛 发、昆虫、植物种子、花粉等。 对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、 脱水和干燥，然后喷镀碳与金属以提高材料的导电性和二次电子产 额。 具体步骤包括： 取材、清洗、固定、脱水、干燥（置换）、粘托、导电处理等。 、透射电镜及超薄切片制备技术 （1）透射电镜 透 射电镜是利用透射电子成像的电子显微镜。 透射式电子显微镜的总体结构包括镜体和辅助系统两大部 分，镜体部分包含： 照明系统（电子枪和聚光镜）、成像放大系统（样品室、物镜、中 间镜和投影镜）、观察记录系统（观察室、照相室）。 辅助系统包含： 真空系统（机械泵、扩散泵和真空阀）、电路系统（电源变换和调 整控制）、水冷系统。 （2）透射电镜样品制备要求 样品彻底干燥、要提高样 品反差、样品要薄。 （3）超薄切片制备技术 由于一般透射电镜的电子束穿 透能力较弱，必须把标本切成厚度小于 100nm的薄片，这种薄片称 为超薄切片，超薄切片的厚度通常为 50-70nm。 超薄切片的制作流程与石蜡切片类似，包括取材、固定、脱 水、渗透、包埋、聚合、修块、切片、染色等步骤。 实验步骤 1 、常规扫描电镜样品制备技术 （1）基 本方法 （2）样品观察面的处理方法 ？ ？ 样品断裂面处理 方法 （3）干燥的干燥方法 ？ 自然干燥法 ？ 真空干燥 法 ？ 冷冻真空干燥法 ？ 临界点干燥法（临界点干燥仪） （4）样品的导电处理 ？ 真空镀膜法 ？ 离子溅射镀膜法（离 子溅射仪） ？ 组织导电技术 2 、超薄切片制备技术 （1）、基本方法 取材漂洗（生理盐水前固定（2.5%戊二醛，4oC 冰箱2小时以上）漂洗（0.1M磷酸缓冲液/ 3次/ 45分钟）后固 定（1%钺酸1小时左右）漂洗（0.1M磷酸缓冲液/3次/45分 钟）梯度脱水浸透、包埋聚合超薄切片饱和醋酸铀染色 30分钟，柠 檬酸铅染色5-8分钟。 透射电镜样品制作操作流程图 （2）半薄切片 ？ 玻 璃刀 ？ 半薄切片机 ？ 修块 （3）超薄切片 ？ 工 具： 超薄切片机、钻石刀、水梢 ？ 超薄切片流程： 切片捞片拨片载网？切片厚度（切片干涉色）？ 载网 ？ 支持膜（4） 支持膜 （4）电子染色样品 ？ 醋酸双氧铀染色及铀污 染 ？ 柠檬酸铅染色及铅污染 3 、H-7000型透射电子显微镜 的主要结构 （1）镜筒结构 （2）电子光学系统 在这 个系统中，主要包括共用电源、高压电源、透镜电源、束偏转电源、 控制电路、相机电源以及CRT显示电路。 （3）真空系统和冷却系统 电子控制系统 H-7000 透 射电镜的真空系统是有两套真空线路构成的， 因此，它拥有两套抽真 空设备，即两三台油旋转泵和两台油扩散泵；其他组成部分包括： 真空管道、预抽管道、预抽室（胶片干储装置）、潘宁规（PE）、普 拉宁规（PL）、抽真空指令装置和保险装置。 冷却系统包括： 冷却水循环装置和整机冷却管道。 4 、上机操作 观察到的视野 真空系统 实验结 论 思考题： 、对比石蜡切片制作，描述常规扫描电镜生物样品制备流 程、透射电镜超薄切片制作流程。 扫描电镜生物样品主要分两大类，一类为含水量少的硬组 织，如毛发、牙齿及植物的花粉、抱子、种子等。 此类样品一般含硅质、钙质，角质，祛琅质和纤维素等成份，所 以通常只经过表面清洁、装台（粘胶）、导电