分子诊断学：核酸扩增技术.pptVIP

Rule out 90% of agents which cause acute gastroenteritis in single test.1,2,3 Simultaneously screens for eleven different bacteria, viruses, and parasites commonly responsible for diarrhea with same day results. xTAG GPP Assay – FDA Cleared! * | ? Copyright 2012 Luminex Corporation ONE test for… Campylobacter Clostridium difficile, Toxin A/B Escherichia coli O157 Enterotoxigenic E. coli (ETEC) LT/ST Shiga-like Toxin producing E. coli (STEC) stx1/stx2 Salmonella Shigella Rotavirus A Norovirus GI/GII Giardia lamblia Cryptosporidium …ELEVEN confident results FDA Cleared 1 Scallan E., Hoekstra RM, Angulo FJ, Tauxe RV, Widdowson M-A, Roy SL, Jones JL, and Griffin PM. Foodborne illness acquired in the United States – major pathogens. Emerg Infect Dis. 2011; 17:7-15. 2 Scallan E, Griffin PM, Angulo FJ, Tauxe RV, and Hoekstra RM. Foodborne illness acquired in the United States – unspecified agents. Emerg Infect Dis. 2011; 17:16-22. 3 Kuntz JL, Johnson ES, Raebel MA, Petrik AF, Yang X, Thorp ML, Spindel SJ, Neil N, and Smith DH. Clostridium difficile infection, Colorado and the northwestern United States, 2007. Emerg Infect Dis. 2012; 18:960-962. Simple Workflow – Same Day Results The Alere? iNAT Platform Qualitative Pathogens PCR * * 同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝。 然后利用T7 RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个（100～1000个）RNA拷贝； 带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况； 同时，每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环。? * 以16S rRNA为靶核酸进行扩增，可以用于细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌等的检测。 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * 在PCR初期，扩增效率为100%，扩增产物指数显示增加。随着反应进行，反应成分被消耗，反应速度降低，扩增产物不再呈指数形式增加，而进入线性增长期。在扩增20~25个循环后，产物增加出现停滞效应，进入平台期。PCR扩增曲线呈S形 * 分子信标(molecular beacons)探针 背景信号低、灵敏度高、特异性强、操作简单 用于基因突变、DNA/蛋白质相互作用、DNA/RNA杂交的动力学研究 实时PCR的优点 定量的方法 外标法 内标法 动力学方法 外标法 内标法 已知浓度的标准品与待测标本在同一管内扩增，然后通过内标的量计算待测模板核酸的量，排除了因管间扩增效率不同导致的差异。 重复性好 定量准确 内部标准品 非竞争性标准品 与靶核酸无相同的引物结合位点和扩增的基因组，常用β-actin, GAPDH, rRNA等管家基因 竞争性标准品 人为构建的可与靶核