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蛋白质分离 ? 最常用的蛋白质分离技术是 20 世纪 70 年代发明的双 向电泳（ 2-DE ），是根据蛋白质的等电点不同在 pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（ IEF) ， 然后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳。 蛋白质分析 蛋白质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为 气相离子 ， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定 质量与电荷比 值 （ M/Z 值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的 离 子 ， 确 定 离 子 的 M / Z 值 ， 分 析 鉴 定 未 知 蛋 白 质 。 ? 两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附 / 离子化（ MALDI) 、电喷雾离子化（ ESI) ? 噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以 融合蛋白 的形式表达在 种技术。 将不同蛋白的 cDNA 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。 将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵” 蛋白与“猎物”蛋白之间的相互作用，可 将展示库中与固定化的“诱饵”蛋白有相 互作用的“猎物”蛋白分离纯化出来，再 对“猎物”蛋白进行质谱鉴定。 噬菌体表面 的一 插入噬菌体载体进 表面等离子共振技术（ SPR ） SPR 是利用单色偏振光与金属膜内表面店子发生的 等离子共振 时， SPR 角 （反射光强度最小时的入射角） 与金属表面结合的生物分子的质量呈正比，如将“诱饵” 蛋白座位配基，固化在几十纳米的金属膜表面，加入 “猎物”蛋白溶液，这样就可以通过 SPR 角的改变来反映 “诱饵”蛋白与“猎物”蛋白形成的蛋白质复合物从而反映 二者的相互作用。 荧光共振能量转移技术 ? ? 荧光共振能量转移是指两个荧光发色 基团在足够靠近时，当供体分子吸收 一定频率的光子后被激发到更高的电 子能态，在该电子回到基态前，通过 偶极子 相互作用，实现了能量向邻近 的受体分子转移（即发生能量共振转 移）。 CFP 的发射光谱与 YFP 的吸收光谱有 相当的重叠，当它们足够接近时，用 CFP 的吸收波长激发， CFP 的发色基 团将会把能量高效率地共振转移至 YFP 的发色基团上，所以 CFP 的发射 荧光将减弱或消失，主要发射将是 YFP 的荧光。 Protein microarray （蛋白质芯片） 是 DNA 芯片技术的扩展，即在 固体支持物 表面高密度地固定化 排列 探针蛋白点阵 ，以特异地捕获样品中的 靶蛋白 ，然后通过 检测器对靶蛋白进行定性或定量分析。 作为规模化功能蛋白质组学研究的手段的蛋白质芯片技术， 免疫共沉淀技术 当细胞在 非变性 条件下被裂解时， 完整细胞内存在的许多蛋白质与蛋白 质的相互作用被保留下来，如果用蛋 白质 X 的抗体免疫沉淀 X, 那么与 X 在 体内结合的蛋白质 Y 也能沉淀下来， 经 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ，沉淀复 合物被分开，然后用 免疫印记或质谱 检测目的蛋白。 Pull-down 技术 该技术是固化的、已标记的诱饵蛋白或标签蛋白（生物素、 Poly-His 或 GST ），从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。 利用该技术可以确定已知蛋白与钓出蛋白或已经纯化的相 关蛋白间的相互作用关系，从体外转录或翻译体系中检测出蛋 白相互作用关系。 蛋白质表达模式研究流程 分子生物学实验技术 一、基因克隆技术 ? ? ? ? ? 目的基因和载体 限制性内切酶酶切 DNA 连接酶连接 转化 抗性筛选 基因克隆实验的一般过程 获得基因序列：通过 RT-PCR 或基因组数据库获得 引物设计及 PCR 扩增目的片段 PCR 产物连接到载体上构建成重组载体 重组载体转化到大肠杆菌中进行质粒扩增或表达蛋白 抗性筛选 质粒转化大肠杆菌的过程 感受态 非定向克隆 + 或 定向克隆 克隆的片段只能按 + 特定方向 连接 Ap a LI (1 7 8 ) P(BL A) Ap a LI (2 3 6 7 ) AL PH A Eco R I (3 9 7 ) Ava I (4 1 3 ) Xm a I (4 1 3 ) S m a I (4 1 5 ) Eco R I Hind III PCR 扩增 Eco R I