临床酶法分析原理及方法.ppt

第*页 常采用双试剂剂型排除干扰。 应用抗坏血酸氧化酶和胆红素氧化酶加入试剂Ⅰ中，可排除样本中维生素C和胆红素干扰。 第*页 第五节 酶循环测定的原理与方法 酶循环测定法是酶法分析的发展和延伸。酶循环测定法的关键技术是利用酶促反应中的酶在反应前后质和量都不改变的特性，只要有足够的底物，即可一直催化反应下去，底物靠其生成的非信号产物循环提供，使可测信号越来越大，提高了检测的灵敏度。 第*页 酶循环测定法利用底物和辅酶之间的循环反复反应，只需要有少量的底物和辅酶，就可使待测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数。反应产物增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，达到高灵敏度和高特异性的要求。 第*页 产物循环-氧化酶-脱氢酶系统使用两种酶，即一种氧化酶作用后使底物发生氧化，氧化产物经一种脱氢酶催化其回到还原状态，促使底物和底物的氧化产物进入循环。在底物和产物循环的同时伴有H2O2的生成和NADH向NAD+的转变 （图25-1） 。 一、产物循环氧化酶脱氢酶系统 第*页 图25-1 产物循环-氧化酶-脱氢酶系统 第二十五章临床酶法分析的原理与方法 第*页 教学目标与要求 ` 掌握 临床酶法分析的概念，脱氢酶和过氧化物酶指示系统的应用原理。 ` 熟悉 临床酶法分析的理论基础，酶循环法以及其它酶法分析的设计原理。 ` 了解 临床酶法分析的发展前景。 第*页 主要内容 酶法分析方法的理论基础 酶反应前后光吸收变化测定的与原理与方法 脱氢酶指示系统测定的原理与方法 酶循环测定的原理与方法 酶激活与酶抑制测定的原理与方法 过氧化物酶指示系统测定的原理与方法 第一节 酶法分析方法的理论基础 酶法分析是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂、抑制剂以及酶偶联法测定酶活性等的一类方法。 临床酶法分析是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。 第*页 第*页 优 点 1 由于酶作用的特异性高，成份复杂的血清等体液样品不需进行预处理就能测定，简化了实验程序 2 由于酶具有高催化效率，加快了反应速度，提髙了工作效率 3 试剂酶的本质大多是蛋白质，酶促反应的条件温和，没有毒性，避免了化学品对人体的危害和对环境的污染 4 制成试剂盒即可以手工操作，又可以自动化分析 酶法分析的优点 酶法分析根据检测类型可分为平衡法（终点法）和速率法（动力学法）。 根据方法设计的原理不同分为：酶反应前后光吸收变化测定法、脱氢酶指示系统测定法、过氧化物酶指示系统测定法、酶循环测定法和酶激活与酶抑制测定法等。 第*页 第*页 酶法分析 酶反应前后光吸收变化测定法 脱氢酶指示系统测定法 过氧化物酶指示系统测定法 酶循环测定法 酶激活与酶抑制测定法 平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小（1%～5%）时，指示反应信号逐渐达到稳定，即通常所说的终点，所以又称为终点法。 第*页 一、平衡法测定的理论基础 将米氏方程改写为： 第*页 公式25-1 积分得： 当反应达到平衡，假设 ，即 [S0]－[St] ≈ [S0]，则可简化为： 第*页 说明达到平衡所需的时间与Km、Vmax和[S0]有关，Km越小、Vmax越大、[S0]越小则达到平衡所需的时间越短。 若 [S0] Km，公式25-1式简化为： 第*页 积分得： 如同时检测标准管，则不管反应进行至何种程度，只要标准管与测定管的反应时间（t）一致，则有： 标准管的 [S0－St] 与待测管的 [S0－St] 分别代表消耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光度来表示（As和Au）。标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示为Cs和Cu。 第*页 公式25-2 公式25-3 速率法测定的是酶促反应的速度（通常是指初速度），其依据是，当底物的消耗量较小时（5%），酶促反应呈一级反应，此时的酶促反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。 ①当[S] Km，则[S]+ Km ≈ Km，②当酶量固定不变时，酶促反应的最大速度Vmax也不变，此时, 酶促反应符合一级反应。 第*页 根据米氏方程： 二、速率法测定的理论基础 如同时检测标准管，则有： 第*页 公式25-4 标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示为Cs和Cu，速度用△ A/min来表示。上式改写为： 公式25-5 公式25-5就是速率法测定代谢物浓度的原理，其前提条件是测定酶促反应的初速度。随着酶促反应的进行，[S]越来越小，v也越