生物化学试验：乳酸脱氢酶(LDH)同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳分离法.pptVIP

乳酸脱氢酶(LDH)同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳分离法 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和流程； 验证同工酶理论； 了解圆盘凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶的方法。 一、实验目的 1. 聚丙烯酰胺凝胶的制备和作用 二、基本原理 (1)凝胶制备（主要试剂）： 丙烯酰胺单体：可聚合成长的直链 粉剂有毒，液体无毒 甲叉双丙烯酰胺：为交联剂 过硫酸铵：催化剂 四甲基乙二胺(TEMED)：加速剂 （最后加，并决定凝胶形成的速度） 在催化剂作用下，丙烯酰胺单体聚合成长链，并通过甲叉双丙烯酰胺交联构成三维网状结构的凝胶； 网状孔径大小主要由丙烯酰胺浓度决定； 一般是7.5% 浓度↑→ 孔径↑ (2)凝胶电泳原理： ① 电荷效应： 凝胶网孔对样品颗粒移动有阻力； 阻力大小取决于孔径与样品分子量之比 分子量越小，阻力越小，移动越快。 调pH →偏离蛋白质的pI → 蛋白质带电荷 带电荷蛋白质在均匀电场中移动 ② 分子筛效应： 2. 乳酸脱氢酶同工酶的分离 一组同工酶之间的分子结构不同 ↓ pI、分子量不同 ↓ 电荷效应、分子筛效应不同 分子量越小、带电荷越多，移动越快 人体乳酸脱氢酶同工酶移动速率： LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5 2. 显色原理 LDH催化的酶促反应； PMS：吩嗪二甲酯硫酸盐 NBT：氯化硝基四氮唑蓝 通过电泳后的显色反应，能验证同工酶的概念（为什么？） 三、操作步骤 封口：用带玻璃珠的胶管套在玻璃管的下端； 用小烧杯配制凝胶液：P 129 （TEMED：加 1 滴，最后加，加后立即混匀灌注，不能出现凝固） 灌注：P 129。注入距玻璃管上端2cm处。 （不能灌满；一杯可灌 2 个柱） 待凝固后拔掉下端封口胶管 （水与凝胶界面出现折光分界线，即凝固） 1. 凝胶柱的制备 将凝胶璃管插入上电泳槽底板孔中； 上电泳槽底板插满胶璃管后倒入少量电泳缓冲液，检查有无渗漏(不能有渗漏) 上电泳槽倒入电泳缓冲液，要淹没所有玻璃管上端，以及电极丝； 下电泳槽倒入电泳缓冲液，要淹没电极丝； 将上电泳槽按放到下电泳槽上，检查玻璃管下端有无气泡(若有，要用水吹掉) 2. 安装电泳槽 血清样品液含 溴酚蓝：电泳指示剂 蔗糖：增加样品液比重 取50ul样品液，加入凝胶玻璃管上端； 3. 加样 4. 电泳 电压250 V，时间60 min； （电泳温度不能过高，否则酶变性） 待溴酚蓝移动接近玻璃管下端出口时，断电； P 129（要避免凝胶条断裂） 5. 剥胶 6. 显色 电泳结束前10 min配制显色液： P 129 （配好后避光，PMS 临染色前再加） 酶促反应条件：37 ℃、20min； 漂洗：先用水洗 再放入 7% 醋酸浸泡脱色 四、结果 绘画出电泳结果 标注：正负极 LDH同工酶类型 溴酚蓝 + - LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5 五、讨论 电泳分离效果如何？ （分离出多少条同工酶） 本次实验如何验证同工酶理论？