基因工程载体 PPT.pptxVIP

基因工程载体克隆载体与表达载体克隆载体:携带外源DNA进入受体细胞并 使外源DNA大量扩增。表达载体:表达外源基因编码的蛋白质,载体克隆位点的上游应含有启动子,下游含有转录终止序列。第一 节、 质粒 Plasmid质粒是存在于细菌细胞染色体外、能自主复制的小分子环状双链DNA分子。又称为cccDNA(Covalently Closed Circular DNA)。野生型质粒的大小一般在2-200Kb 基因工程常用质粒在2-4Kb之间 质粒并不是细菌生长所必须的,但可为宿主执行一定的遗传功能,如抗生素的抗性、重金属离子的抗性、细菌毒素的分泌等。质粒 (plasmid)1 、质粒类型: 严紧型质粒(stringent plasmid) 1-5个拷贝/细胞 松弛型质粒(relaxed plasmid): 数十个/细胞 质粒在细胞中的拷贝数有时与寄主的种类有关。2、 质粒载体必须具备的条件(1)分子量相对较小,能在细菌内稳定存在,有较高的拷贝数。(2)具有一个以上的遗传标志,便于对宿主细胞进行选择,如抗生素的抗性基因,β-半乳糖苷酶基因(Lac Z)等。(3)具有多个限制性内切酶的单一切点,便于外源基因的插入。假如在这些位点有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。质粒性质　不相容性(不亲与性) 具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒,不能稳定的存在于同一受体细胞内,这种现象称作质粒的不相容性。 3、 质粒载体的选择性标记抗菌素抗性新陈代谢特性 抗菌素名称 抗菌素作用方式 宿主菌抗性机理氨苄青霉素(Amp) 干扰细菌细胞壁合成 编码?-内酰胺酶,切割Amp ?-内酰胺环氯霉素(Cml)抑菌剂,与50S结合,干扰 编码乙酰转移酶,使氯霉素 蛋白质合成 乙酰化失活卡那霉素(Kan) 杀菌剂,与70S结合,mRNA编码氨基糖苷磷酸转移酶, 发生错读 修饰Kan失活链霉素(Sm) 杀菌剂,与30S结合,mRNA编码特异修饰酶 发生错读四环素(Tet) 抑菌剂,与30S结合,阻止 编码特异蛋白,修饰细菌膜 蛋白合成 结构,阻止Tet通过细胞膜复制起点氨苄青霉素抗性基因常用的质粒载体　1、　pBR322　2、　ｐＢＶ220载体是我国预防医学科学院病毒研究所自行构建的大肠杆菌温控表达载体。　3、　pUC系列:如pUC118、pUC119,两者之间的差别在于多克隆位点不同。4、融合表达载体　如GST融合表达系统。载体中含有细菌的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)基因,外源基因克隆在GST基因的下游。当基因表达时,表达产物为GST与目的蛋白的融合体。融合表达载体的优点表达效率高融合蛋白易纯化: 抗GST的蛋白质作为特异性抗体, 用亲与层析法从细胞裂解液中纯化出融合蛋白;可从融合蛋白中分离出单一的外源蛋白质GST与外源蛋白之间克隆上蛋白酶的切割位点,可用适当的酶切割。　例如加装一段编码　Ile-Glu-Gly-Arg寡肽序列的人工接头片断,该片断可被具有蛋白酶活性的凝血因子Ⅹa切割,从Arg后切开。目的蛋白中出现此种序列的估计性极小,因此该方法用途广泛。　QIAexpress 6?His表达系统重组蛋白质的末端带有6个组氨酸残基,对带有Ni离子的层析介质有高度的亲与力,易于纯化。6个组氨酸残基质量小,不影响蛋白质的结构与功能,无需切除。6个组氨酸残基免疫原性差,重组蛋白能够直截了当用做抗原。 第二节 噬菌体类 噬菌体是一类细菌病毒的总称,英文名为Bacteriophage,简称phage。噬菌体能够在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命,但必须依赖寄主细胞才能复制生长。噬菌体(bacteriophage, phage)噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。病毒的特性:个体微小,能够通过细菌滤器没有完整的细胞结构,由蛋白质与核酸组成专性细胞内寄生的微生物可分为12个科噬菌体的生物学性状噬菌体的生物学性状形态个体小,需用电子显微镜观察蝌蚪形、微球形与丝形The black bars are size bars representing 100 nm、 用作克隆载体的噬菌体有两类:一类是λ噬菌体,另一类是M13噬菌体。 野生型λ噬菌体经过改造,已衍生出100多种克隆载体。 λ噬菌体载体分为插入型与替换型(置换型)两类。 目前应用较广的是EMBL系列、λgt系列与Charon系列等。 λ噬菌体(lambda phage) λ噬菌体是能够感染