一种降低或消除二代测序中扩增产物污染的方法及应用发明专利.pdfVIP

一种降低或消除二代测序中扩增产物污染的方法及应用 技术领域 本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种降低或消除二代测序过程中扩 增产物核酸污染的方法及应用，特别是涉及一种降低二代测序平台的多重PCR 法建库过程中气溶胶污染水平的方法以及所述方法在新型冠状病毒2019-nCoV 基因组测序中的应用。 背景技术 新冠疫情爆发以来，核酸检测技术迅速成为病情确诊、人群筛查的主流检测 手段，但最常用的分子诊断技术如PCR 也只能识别既定靶标，无法检测未知突变， 但新冠病毒变异速度快，序列多样性丰富，世界范围内不断有新的病毒亚型被发 现和上传，因此依赖已知序列的荧光PCR 法已经无法满足对未知突变和基因亚型 的检测需求。基于二代测序的新冠病毒基因组检测序列可覆盖19-nCoV 序列全 长。弥补了RT-PCR 只可检测少量2019-nCoV 已知区域的缺点，不但可以提高检 测的准确性，而且可以对病毒可能的变异进行鉴别。 基因组测序手段有宏基因组和靶向富集检测两种，但目前宏基因组存在着对 样品内全部核酸无差别检测的弊端，高占比的人源核酸不仅降低了检测灵敏度， 还会因不同样品的占比差异导致检出信号强度不稳定，产生假阴性。靶向富集多 采用多重PCR 的手段用富集目标病原基因组序列的方法去除人源核酸的干扰，但 特异引物组多重扩增使用的循环数高，而且二代测序中多重PCR 产物易造成交叉 污染和气溶胶污染，产生假阳性。 扩增产物核酸污染是二代测序进行基因组检测中常见的污染问题，由于扩增 产物拷贝数大(一般为10 13 拷贝/ml)，远远高于PCR 检测限，所以极微量的扩增 产物污染，就可形成假阳性。常见造成扩增产物污染的形式是气溶胶污染，在空 气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、 吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染，据计算一个气溶胶颗粒 可含48000 拷贝，因而由其造成的污染是影响二代基因组测序准确性的重要因 素。 将核酸反应产物与样品来源的核酸进行差异化，从核酸反应试剂组分中来解 决污染问题是很多试剂厂家在努力的方向，其中UNG 酶的预防作用日益受到重 视和肯定。在PCR 产物或引物中用dU 代替dT。这种dU 化的PCR 产物与UNG 一起孵育，因UDG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU 而阻止Taq-DNA 聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG 对不含dU 的模 板无任何影响。UNG 可从单或双链DNA 中消除尿嘧啶，而对RNA 中的尿嘧啶和 单一尿嘧啶分子则无任何作用。在扩增反应中用dUTP 代替dTTP，使产物中掺入 大量dU。在再次进行PCR 扩增前，用UNG 处理PCR 混合液即可消除PCR 产物 的残留污染。由于UNG 在PCR 循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含 dU 的新的PCR 产物。但是由于酶的反应效率有限而消化反应时间往往只有5 分 钟，这种方式一般只能用UNG 处理PCR 混合液中的轻度PCR 产物污染，不能彻 底解决问题。 发明内容 为了解决二代测序中扩增产物核酸污染导致的假阳性问题，本发明提供一种 降低或消除二代测序过程中扩增产物核酸污染的方法以及在新型冠状病毒 2019-nCoV 检测中应用。针对二代测序平台常见的假阳性问题，通过长片段扩增 -扩增子片段化的方案建库，由于建库过程中扩增子进行了片段化，这些片段化 的扩增子即使污染了下一批次的样本也无法进行扩增。在长片段扩增体系中还使 用了dUTP 和能够特异性识别含dUTP 核酸的核酸酶。通过对PCR 产物和文库片 段用dUTP 标记，并在下次检测前消化含U 的DNA 片段，实现降低实验中受到 气溶胶污染的技术效果。本发明所述方法可降低或消除由扩增产物污染导致的假 阳性，提高检测的准确率。 具体而言： 一方面，本发明提供一种降低或消除二代测序过程中扩增产物核酸污染的方 法，其特征在于：建库过程中先扩增获得长片段，然后将长片段扩增产物片段化 为至少两个适合测序的短片段，使片段化后适合测序的短片段不同时含有扩增所 述长片段的上游引物和下游引物； 其中，建库过程中进行扩增获得长片段的扩增反应体系中含有dUTP，使至 少一个dUTP 掺入到长片段扩增产物中。 进一步，本发明所述降低或消除二代测序过程中扩增产物核酸污染的方法， 其特征在于：对测序样品进行扩增获得长片段的扩增反应体系中含有能够特异性 识别含dUTP 的核酸的酶。 进一步，本发明所述降低或消除二代测序过