一种降低或消除二代测序中扩增产物污染的方法及应用发明专利.docxVIP

一种降低或消除二代测序中扩增产物污染的方法及应用 技术领域 本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种降低或消除二代测序过程中扩增产物核酸污染的方法及应用，特别是涉及一种降低二代测序平台的多重PCR法建库过程中气溶胶污染水平的方法以及所述方法在新型冠状病毒2019-nCoV基因组测序中的应用。 背景技术 新冠疫情爆发以来，核酸检测技术迅速成为病情确诊、人群筛查的主流检测手段，但最常用的分子诊断技术如PCR也只能识别既定靶标，无法检测未知突变，但新冠病毒变异速度快，序列多样性丰富，世界范围内不断有新的病毒亚型被发现和上传，因此依赖已知序列的荧光PCR法已经无法满足对未知突变和基因亚型的检测需求。基于二代测序的新冠病毒基因组检测序列可覆盖19-nCoV序列全长。弥补了RT-PCR只可检测少量2019-nCoV已知区域的缺点，不但可以提高检测的准确性，而且可以对病毒可能的变异进行鉴别。 基因组测序手段有宏基因组和靶向富集检测两种，但目前宏基因组存在着对样品内全部核酸无差别检测的弊端，高占比的人源核酸不仅降低了检测灵敏度，还会因不同样品的占比差异导致检出信号强度不稳定，产生假阴性。靶向富集多采用多重PCR的手段用富集目标病原基因组序列的方法去除人源核酸的干扰，但特异引物组多重扩增使用的循环数高，而且二代测序中多重PCR产物易造成交叉污染和气溶胶污染，产生假阳性。 扩增产物核酸污染是二代测序进行基因组检测中常见的污染问题，由于扩增产物拷贝数大(一般为10?13拷贝/ml)，远远高于PCR检测限，所以极微量的扩增产物污染，就可形成假阳性。常见造成扩增产物污染的形式是气溶胶污染，在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染，据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是影响二代基因组测序准确性的重要因素。 将核酸反应产物与样品来源的核酸进行差异化，从核酸反应试剂组分中来解决污染问题是很多试剂厂家在努力的方向，其中UNG酶的预防作用日益受到重视和肯定。在PCR产物或引物中用dU代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止Taq-DNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。在扩增反应中用dUTP代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。但是由于酶的反应效率有限而消化反应时间往往只有5分钟，这种方式一般只能用UNG处理PCR混合液中的轻度PCR产物污染，不能彻底解决问题。 发明内容 为了解决二代测序中扩增产物核酸污染导致的假阳性问题，本发明提供一种降低或消除二代测序过程中扩增产物核酸污染的方法以及在新型冠状病毒2019-nCoV检测中应用。针对二代测序平台常见的假阳性问题，通过长片段扩增-扩增子片段化的方案建库，由于建库过程中扩增子进行了片段化，这些片段化的扩增子即使污染了下一批次的样本也无法进行扩增。在长片段扩增体系中还使用了dUTP和能够特异性识别含dUTP核酸的核酸酶。通过对PCR产物和文库片段用dUTP标记，并在下次检测前消化含U的DNA片段，实现降低实验中受到气溶胶污染的技术效果。本发明所述方法可降低或消除由扩增产物污染导致的假阳性，提高检测的准确率。 具体而言： 一方面，本发明提供一种降低或消除二代测序过程中扩增产物核酸污染的方法，其特征在于：建库过程中先扩增获得长片段，然后将长片段扩增产物片段化为至少两个适合测序的短片段，使片段化后适合测序的短片段不同时含有扩增所述长片段的上游引物和下游引物； 其中，建库过程中进行扩增获得长片段的扩增反应体系中含有dUTP，使至少一个dUTP掺入到长片段扩增产物中。 进一步，本发明所述降低或消除二代测序过程中扩增产物核酸污染的方法，其特征在于：对测序样品进行扩增获得长片段的扩增反应体系中含有能够特异性识别含dUTP的核酸的酶。 进一步，本发明所述降低或消除二代测序过程中扩增产物核酸污染的方法，其特征在于：所述能够特异性识别含dUTP的核酸的酶选自由User酶、Fpg酶组成的组；在一些实施方式中，所述酶选自1:1的User酶和Fpg酶。 另一方面，本发明还提供一种防止扩增产物核酸污染的二代测序方法，包括以下步骤： (1)引物设计与制备：设计并合成重叠多重PCR引物，使各扩增子长度相当，且扩增子长度大于一个测序反应的长度；例如可使扩增子长度至少约为适合测序长度的2倍； (