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兽药残留检测技术激素类 免疫亲和柱色谱法 免疫亲和柱具有高的专一性,近年来发展迅速,已应用于皮质激素的生物样品制备。 例如,用两种抗体结合的免疫亲和柱,可以分离纯化肝、牛奶、尿样和粪样中9种皮质激素。 免疫亲和色谱与GC-负离子化学电离质谱联用,已用于马组织中双氟美松的确证分析。 兽药残留检测技术激素类 柱切换技术 柱切换技术自动化程度高,在线浓缩和纯化,大大简化了样品的前处理步骤。 例如,牛组织中地塞米松测定时,样液经苯基柱初级分离后流至硅胶预富集柱中,通过柱切换,改变流动相将富集柱中的待测物洗脱至氰丙基分析柱中分离。 兽药残留检测技术激素类 超临界CO2流体萃取法 超临界CO2流体萃取法具有低温、快速、无溶剂萃取的优点。 例如,超临界流体萃取法与HPLC联用,用于牛组织中地塞米松残留的测定。 兽药残留检测技术激素类 （二）同化激素的样品处理 1、样品预处理： 液体样品(尿、血浆、胆汁、牛奶)在提取前,可用水或磷酸盐缓冲液稀释。 半固体样品(肌肉、肝、肾)在提取前需要均质。 脂肪样可在40~60℃ 下加热,使脂肪融化成液体。 兽药残留检测技术激素类 2、提取 生物样品中游离的类固醇激素可以用丙酮、乙醚、乙腈、碱性乙腈、四氢呋喃、叔丁基甲醚和氯仿-甲醇等有机溶剂提取。 激素结合物的水溶性较大,不易被有机溶剂提取,可先将样品水解后再提取游离激素。 常用的水解方法有酶水解和碱水解两种。 酶水解通常使用葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶,前者可专一地水解葡糖苷酸结合物,后者可水解硫酸酯结合物。 兽药残留检测技术激素类 由于尿样和组织中通常同时存在上述两种结合物,常使用葡萄糖苷酸/芳基硫酸酯混合酶,控制pH4.5~7.0,于37℃ 温育过夜。 碱水解通常使用氢氧化钠溶液,由于合成类固醇常以酯制剂注入动物,水解后使酯类释放出游离的类固醇。 兽药残留检测技术激素类 3、净化 粗提取液的净化方法包括液-液萃取、固相萃取法、液相色谱、免疫亲和色谱和超临界流体色谱等。 为了达到更好的纯化效果,可将几种方法结合应用。 兽药残留检测技术激素类 液-液萃取法 液-液萃取大多是去除水溶性提取液中的脂肪, 例如,乙腈或甲醇提取液中加入正己烷或异辛烷,可脱去脂类物质。 脂肪样中的激素(30种雄激素)可用正己烷提取,再用甲醇-醋酸盐缓冲液(pH5.2)提取正己烷中的激素,同时去除脂类物质,水性提取液再用二氯甲烷抽提。 当乙腈粗提取液调节pH至13时,加入正己烷和二氯甲烷进行三相液-液萃取,极性和离子型酸性物质进入水相,脂类等低极性物质则进入上层正己烷相中,而中等极性物质(如待测物：群勃龙和表群勃龙、去甲睾酮和美仑孕酮)进入中间乙腈相中。 兽药残留检测技术激素类 固相萃取法 柱层析采用氧化铝、硅胶和Celite吸附剂,可有效分离分析物和内源性杂质,已应用于肉样中七种类固醇的纯化。 固相萃取法具有简便、快速、经济等优点,已广泛应用于激素类药物的净化。 正相柱常用硅胶、氧化铝、氰基型和氨基型吸附剂,反相柱常用C18和C8吸附剂。 C18固相萃取柱和Amberlite XAD-2离子交换柱适合纯化亲脂性或中性的同化激素。 兽药残留检测技术激素类 司坦唑醇在C18固相萃取柱上的回收率偏低,是由于它的结构为吡唑环和雄(甾)烷环缩合而成,两个活泼氢可解离,具有离子化的性质,可与固定相或玻璃的活性点发生吸附,但其在C8和苯磺酸型的混合固定相小柱中,净化效果和回收率均佳。 C18和硅胶的混合柱同样被用来对粗提取液的纯化。 C8、硅胶和氨基型的混合固定相小柱被成功地应用于肉中同化激素和异化激素的分离,激素按照极性、非极性和酚类性质分段流出,然后再分别纯化。 兽药残留检测技术激素类 固相萃取柱的净化效果有时并不能满足质谱检测的要求,因此有人将固相萃取法与色谱法相结合,对样品提取液作更高的纯化。 另外,还有采用C18柱对样液色谱分离,用自动馏分收集器收集分析物的馏分,馏分收集后吹干,然后衍生化GC分析。 兽药残留检测技术激素类 柱切换技术 柱切换技术也被应用于激素的生物样品制备。 例如,将牛肝提取液注入凝胶柱中,含同化激素的两段馏分被切入到硅胶柱(富集柱)中,群勃龙和去甲睾酮激素在富集柱中被浓缩纯化,洗脱后流入氰基柱中,再通过柱切换,流入硅胶分析柱中分离测定。 兽药残留检测技术激素类 醋酸美仑孕酮为中性、脂溶性的类固醇,固相萃取法对牛组织提取液中醋酸美仑孕酮的提取纯化效果欠佳,故采用柱切换。 其过程为粗提取液注入苯基柱中作初级分离,含分析物的馏分被切换到硅胶预富集柱中,浓缩提纯后再通过柱切换洗脱至硅胶分析柱中分离测定;若收集馏分,可用于GC-MS分析。 兽药残留检测技术激素类 免疫亲和柱色谱法 免疫亲和柱具有专一性高的优点,但适合同化激素纯化的免疫亲和柱目前还