随机引物与oligodT_区别.pdfVIP

1.Oligo(dT) capture 因为 Oligo(dT) 与 mRNA 的 Poly(A) 尾巴可以发生特异性结合， 所以用 Oligo(dT) 特异结 合到 mRNA 上 Poly(A) 尾端， 以此可以特异地将 mRNA 从总 RNA 中分离出来。 属于亲和层 析技术。 2. 反转录（ RT-PCR ） 因绝大多数 真核细胞 mRNA 3 ’端具有 Poly(A) 尾， Oligo(dT) 与其配对，仅 mRNA 可被 反转录 。由于 Poly(A) RNA 仅占总 RNA 的 1-4% ，故此种 引物合成 的 cDNA 比随机六聚体 作为引物所得到的 cDNA 在数量和复杂性方面均要小。但是在 反转录 从 mRNA 获得 cDNA 时，也可以用随机六聚体引物和 特异性 引物。 随机六聚体 引物 ：当特定 mRNA 由于含有使 反转录酶 终止的序列而难于拷贝其全长序 列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA 。用此种方法时，体系 中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板， PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的 特 异性 。通常用此 引物合成 的 cDNA 中96% 来源于 rRNA 。 特异性 引物 ：最特异的引发方法是用含目标 RNA 的 互补序列 的寡核苷酸作为引物，若 PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与 mRNA 3 ’端最靠近的配对引物起始。 用此类引物仅产生所需要的 cDNA ，导致更为特异的 PCR 扩增。 使用 oligo dT 引物扩增的产物 , 可以保证扩增产物包括 mRNA 的 3末端 (减少 rRNA 的干扰 ), 但是 oligo dT primer 扩增有一个问题 , 就是扩增片段的长度和扩增产物所包含的信息量的 问题 , 之所以有长度这个问题 ,一方面和 lz 所提到的 RNA 完整性有关 ,但最重要的限制在于逆 转录酶的延伸能力 . 用 oligo dT primer 扩增可能出现扩增出来的片段长度短 , 虽然都有 mRNA 的 3 端 , 但是序列信息多位于 3-UTR 附近 , 若扩增序列太短 ,则有用信息很少 , 不利 于序列的识别和分析 . 使用 random primer , 也有片段长度的限制 , 但是由于它的逆转录并不一定在 mRNA 的末端 起始 , 而是在随机位置起始 ,所以它的扩增片段带有更多 CDS 的信息 .但是如果是用总 RNA 逆转录的话 ,有可能会受到 rRNA 的干扰 . 至于 Gsp, 只是在扩增已知 gene/gene family 以及部分原理的 RACE 中使用 . 用随机引物时 要去除总 RNA 中的 tRNA rRNA, 只保留 mRNA 如果接下来你的 PCR 产物是外显子，就用 oligo dT; 如果是内含子或者包括部分内含子，就用 random mRNA 反转录之后的 cDNA 为模板进行 PCR，不都是外显子吗？内含子在这之前都被剪切掉 了。所以不知道 “内含子 ... 这句话是什么意思，或者有其他的含义，求解！” 如果你想要做蛋白表达，就用 Oligo dT ，要是你做的基因包括内含子就用随机引物喽。 我最近在用逆转 cDNA 为模板扩增 CDS 序列 （3000bp 左右），同时用 oligodT 和 random 引 物逆转，结果大多数时候两者扩增效果是一样的，少部分情况只有