实验一质粒DNA的提取 .pptxVIP

实验一质粒DNA的提取; 实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论 ;实验目的;实验原理;结构的三大要素: 多克隆位点 选择标记(耐药性,LacZ) 独立的复制单位 种类: 质粒 噬菌体 酵母人工染色体(YAC) 反转录病毒载体 表达载体等;;pET-32a Vector;pET-32 cloning/expression region;;;实验仪器、材料与试剂 ;(二) 材料 ;(三) 试剂 ;2、 溶液Ⅰ:葡萄糖(50mmol/L );Tris·HCl( 25mmol/L, pH8、0); EDTA (10mmol/L) 3、 溶液Ⅱ: NaOH (0、2mol/L) ;SDS ( 1%,新鲜配制) 4、 溶液Ⅲ: 60ml的 5mol/L KAC ; 11、5ml的冰醋酸 ; 28、5ml H2O;5、 氨苄青霉素(Amp) 用无菌水配制成100 mg/ml 溶液,置-20℃冰箱保存备用。 6、 RNaseA 将RNA 酶 A溶于10 mmol/L Tris、Cl (pH 7、5)、15 mmol/L NaCl中, 配成10 mg/ml的浓度,于100℃加热15分钟,缓慢冷却至室温,分装成小份保存于-20℃。 7、 酚/氯仿(1:1),氯仿/异戊醇(24:1),乙醇 ,75%乙醇。 ;实验步骤 ;6、 15,000rpm,离心10min,将上清移至一干净的1、5 ml Eppendorf 管中,注意所取体积(约400 ? l ) 。 7、 加入等体积酚/氯仿(1:1),颠倒数次混匀(注意动作轻),12,000rpm,4℃,离心3min,取上清液。 8、 小心吸取上清液中至一干净的1、5 ml Eppendorf 管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),颠倒数次混匀, 12,000rpm,4℃,离心3min,取上清液。 ;9、 小心吸取上清液中至一干净的1、5 ml Eppendorf 管中,加入2倍体积的无水乙醇,颠倒混匀,于冰上放置10min, 4℃离心,15,000rpm,10min。 10、 弃上清,加1ml 75%乙醇漂洗沉淀, 4℃离心,10,000rpm,5min。 11、 去掉上清(注意沉淀勿丢失),室温或真空干燥沉淀。 12、 加入50 ? l TE buffer,室温振荡溶解质粒DNA。;培养细菌使质粒扩增; ? Tiangen质粒DNA 小量提取试剂盒(实际用) 操作过程 1、 柱平衡:向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500 ? l 的平衡液BL,12,000 rpm 离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。 2、 将1-2ml 过夜培养的细菌菌液加入1、5ml 离心管中,12,000rpm离心1分钟,并弃去上清液。如有需要,可多次重复步骤2,以收集更多细菌菌体。但勿过量,以免影响提取质粒的质量。 3、 加200 ? l 溶液P1(用前检查是否已加入RNase A),重悬细菌体沉淀,使用移液器或涡旋振荡器完???悬浮细菌沉淀。;4、 加200 ? l 溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意不要剧烈振动,以防止基因组DNA 被打断,注意不要让反应持续超过5 分钟。 5、 加300 ? l 溶液P3,马上轻柔颠倒离心管6-8 次,充分混匀,此时溶液应该出现白色絮状沉淀。 6、 12,000rpm离心10 分钟。 如离心机转速不够可延长离心时间,直至形成紧密的白色沉淀。 7、 将步骤6 离心后得到的上清液转移到吸附柱CP3中,12,000rpm离心30-60秒,并弃去接液管内液体。 8、 向吸附柱CP3 内加600 ? l漂洗液PW ,12,000rpm 离心30-60 秒,并弃去收集管内废液。 9、 重复第8 步一次。;感谢您的聆听！