小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数.pdfVIP

小 鼠 脾 脏 细 胞 原 代 培 养 及 观 察 计 数 【实验目的】 1. 学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养； 2. 掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用； 3. 学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法； 4. 学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数； 【实验原理】 A. 细胞培养 细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使 离体的细胞在体外生长和繁殖， 并且维持其结构和功能的一种培养技术。 动物细胞培养可分为原代培 养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组 织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。 当培养的动物细胞生长增 殖达到一定密度， 形成致密的单层细胞时， 用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞， 从一个容器中以 1： 2 或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是 细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体， 在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动 是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培 养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料， 对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开 生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变 细胞的遗传性状和特性， 使其向有利于人类健康长寿的方向发展。 因此动物细胞体外培养技术是研究 细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞培养的意义 : 具有其他生物技术无可比拟的优点； 培养条件易改变和控制， 便于单因子分析； 便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、 细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。 细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结 果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。 培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适 PH、营养条件和 培养基质等。 B. 细胞死活鉴定 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异： ① 细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许 物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、 苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述 染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生 死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压 溶液接触时不产生质壁分离。 ② 代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此， 发展处了以荧光素二乙酸酯（ FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的 荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的 酯酶具有较强的活性， 可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素， 该物质不能自由透过活的 细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去 活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞 的生死状态。 亚甲基蓝是一无毒染料， 氧化型为蓝色， 还原型为无色。 活细胞因具有较强的还原能力， 能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型， 故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后