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PAGE PAGE 1 PCR反应体系标准的PCR反应体系 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是20世纪80年月中期进展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、迅速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要讨论的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能挺直观看和推断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中，扩增出足量的DNA供分析讨论和检测鉴定。过去几天几星期才干做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 10×扩增缓冲液，10μ1; 4种dNTP混合物，各200μmol/L；引物，各10-100pmol/L；模板DNA，0.1-2μg; Taq DNA聚合酶，2.5U;Mg2+，1.5mmol/L；加双或三蒸水至l00μl。PCR反应五要素：参与PCR反应的物质主要有5种，即引物、酶、dNTP、模板和Mg 2+。引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核昔酸链作引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循的原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右；②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段；③引物碱基：G+C含量以40％-60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易浮现非特异条带。ATGC最好随机分布，避开5个以上的嚎吟或e陡核昔酸的成串罗列；④避开引物内部浮现二级结构，避开两条引物间互补，特殊是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；⑤引物3’端的碱基，特殊是最末及倒数其次个碱基，应严格要求配对，以避开因末端碱基不配对而导致PCR失败；⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有相宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有益处；⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列无显然同源性。引物量：每条引物的浓度0.1-1μmol/L或10-l00pmol/L，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增强引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度：目前有两种Taq DNA聚合酶，一种是从栖热水生杆菌中提纯的自然?酶；另一种为大肠埃希菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应，约需酶量2.5U（指总反应体积为100μl时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量削减。dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有疏远关系。dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，应用1 mol/L NaOH或1 mol/L Tris，将其配成高浓度。然后，再用HCl缓冲液，将其pH调整到7.0-7.5，小量分装，-20℃冰冻保存，因多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50-200μmol/L，尤其是注重4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其他几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2＋结合，使游离的Mg2+干浓度降低。模板（靶基因）核酸：模板核酸的量与纯化程度是PCR成败与否的关键环节之一。传统的DNA纯化办法通常采纳SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特殊是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提除去蛋白质和其他细胞组分，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。普通临床检测标本，可采纳迅速简便的办法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，挺直用于PCR扩增。RNA模板提取普通采纳异硫氰酸肌或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。Mg 2＋浓度：Mg2＋对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在普通的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L时，Mg2＋浓度为1.5-2. 0mmol/L为宜。Mg2＋浓度过高，反应特异性降低，浮现非特异性扩增；浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物量削减。