人血高密度脂蛋白对内毒素血症急性肝衰竭小鼠的防护作用医学.docVIP

人血高密度脂蛋白对内毒素血症急性肝衰竭小鼠的防护作用医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：人血高密度脂蛋白对内毒素血症急性肝衰竭小鼠的防护作用医学 1 1材料和方法 2 文2：人血高密度脂蛋白对内毒素血症急性肝衰竭小鼠的防护作用 5 1材料和方法 5 参考文摘引言： 8 原创性声明（模板） 9 文章致谢（模板） 10 正文 人血高密度脂蛋白对内毒素血症急性肝衰竭小鼠的防护作用医学 文1：人血高密度脂蛋白对内毒素血症急性肝衰竭小鼠的防护作用医学 0引言 高密度脂蛋白(highdeitylipoprotein, HDL)颗粒小,蛋白质含量高，主要为apoAⅠ，Levels等［1］报道HDL可以介导细菌内毒素清除和脱毒. 内毒素血症与肝损害互为因果，在重型肝炎发病中具有重要作用. 但至今临床上尚无真正的抗内毒素药物. 我们用人血浆纯化HDL治疗急性肝功能衰竭小鼠内毒素血症， 观察其对肝脏的保护作用， 并进一步研究其机制. 1材料和方法 材料 正常人新鲜血浆200 mL，密度梯度离心（日立CP100MX型超速离心机）收集密度在～ g/cm3的HDL部分，透析浓缩后考马斯亮蓝测定蛋白含量. 另外取最底层无脂蛋白血浆部分（LFF，d＞）透析浓缩. HDL纯度鉴定采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为6%，血浆超离心各种脂蛋白层各取25 μL加SDS制备样品，点样，恒流20 mA，样品进入分离胶后恒流30 mA，电泳3 h 30 min. 方法 Babl/c小鼠（购于 中国 科学 院上海实验动物中心）60只，体质量(18±2) g，随机分为3组，每组20只，雌雄各半，每只小鼠ip内毒素LPS（来自大肠杆菌血清型O55∶B5，Sigma） 15 mg/kg和半乳糖胺（GalN, Sigma） 500 mg/kg混合液（总体积500 μL）. 治疗组分别于造模前 h及造模后1，2，4 h尾静脉iv HDL+LFF（37℃预培育3 h）注射剂量HDL 40 mg/kg，LFF 5 mL/kg；LFF对照组注射LFF 5mL/kg；生理盐水对照组注射等量生理盐水. 连续72 h观察小鼠存活情况. 取小鼠适量肝、脾、肾、肺、心、脑组织用40 g/L的甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规切片，HE染色. 另剪取新鲜瘤组织50 mg，加Trizo1（GIBCO公司） 1 mL，充分匀浆后按照说明书步骤提取总RNA，以其为模板严格按反转录试剂盒（Promega）说明书逆转录合成cDNA后， PCR扩增体系参照 文献 ［2］，以βactin为内参照. PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析仪（GELDOCL1000型）分析，所用引物是根据基因库中小鼠cDNA序列应用Oligo软件自行设计，由上海生物工程公司合成（表1）.表1PCR扩增的引物序列、片段长度、退火温度及循环数 统计学处理：采用χ2检验. P认为有统计学意义. 2结果 SDSPAGE显示各种脂蛋白（VLDL，LDL，HDL）分离完全，表明采用超速离心法从人血浆纯化HDL的纯度和特异性均好. 对小鼠肝衰竭的保护作用 HDL+LFF具有显著抗内毒素及半乳糖胺致死作用，而单纯LFF抗致死作用不明显. 各组小鼠死亡率分别为：模型组为85%，LFF对照组为80%，HDL治疗组15%（χ2=，P）. 模型组小鼠肝细胞混浊肿胀，大量肝细胞坏死，肝窦及汇管区炎细胞浸润，心、脑、肺、脾、肾组织学未见明显异常. LFF对照组病理改变与模型组类似. 而HDL治疗组小鼠肝细胞仅见肝细胞混浊肿胀等变性和轻微坏死（图1）.A: 模型组; B: LFF对照组; C: HDL治疗. 对肝衰竭小鼠肝细胞因子的影响 模型组肝组织TNFα和IL6 mRNA表达水平增高，LFF对照组与模型组无差异，HDL 治疗 组TNFα和IL6 mRNA表达水平接近正常小鼠（图2） 3讨论 内毒素含脂质A，脂蛋白是体内脂质运载的工具，因此，脂蛋白可以结合内毒素，是天然存在的细胞外LPS清除剂. 本研究显示HDL能显著降低内毒素所致肝功能衰竭小鼠的死亡率. 模型组小鼠肝脏发生广泛变性坏死，肾、脾、心、脑组织未见类似改变，与 文献 报道用半乳糖胺敏化内毒素选择性诱导小鼠肝功能衰竭相一致［3］，LFF对照组小鼠肝脏组织学改变与模型组相似，HDL+LFF治疗组小鼠肝脏仅见轻微变性坏死；DNA片断化分析模型组小鼠肝细胞DNA呈现凋亡特征性梯状条带，而HDL治疗组则无此改变，说明肝细胞凋亡也是内毒素所致肝功能衰竭的一种重要病理形式. Johton等［4］研究表明，C57BＬ/6小鼠吸入LPS能够诱导肺组织产生强烈的中性粒细胞反应，使TNF