苦参碱诱导人前列腺癌pc3m细胞凋亡及对骨桥蛋白表达的影响临床医学.docVIP

苦参碱诱导人前列腺癌pc3m细胞凋亡及对骨桥蛋白表达的影响临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：苦参碱诱导人前列腺癌pc3m细胞凋亡及对骨桥蛋白表达的影响临床医学 1 1 材料与方法 2 2 结 果 4 3 讨 论 5 文2：吡格列酮诱导前列腺癌PC3细胞凋亡的实验研究 6 1 材料与方法 6 2 结果 8 3 讨论 10 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 苦参碱诱导人前列腺癌pc3m细胞凋亡及对骨桥蛋白表达的影响临床医学 文1：苦参碱诱导人前列腺癌pc3m细胞凋亡及对骨桥蛋白表达的影响临床医学 骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是近年来发现的一种分泌型磷酸化糖蛋白,参与骨代谢、动脉硬化及抗感染免疫反应等过程〔1〕,近年来的研究表明,OPN的表达与肿瘤的生长与转移有关〔2〕。苦参碱是从我国传统中药苦参中提取出的一种生物碱活性成分，具有广泛的药 理学 作用。近年来，苦参碱对于其他肿瘤细胞作用的研究报道日见增多，其体内外的抗肿瘤活性受到极大关注。我们观察了苦参碱诱导人前列腺癌pc3m细胞凋亡及对OPN表达的影响,探讨苦参碱用于前列腺癌治疗的可行性及机制。 1 材料与方法 材料 前列腺癌细胞株pc3m由吉林大学基础医学院病理学教研室惠赠。苦参碱注射液(云南白云山药业有限公司)。RPMI1640培养基(GIBCO公司);小牛血清(天津灏洋)；噻唑蓝(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)(北京博奥森);RTPCR扩增试剂盒(TAKARA公司);OPN、三磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)引物(上海生物工程技术公司合成)；Trizol Reagent(晶美生物)；Annexin VFITC细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物)。酶标仪(日本);SWCJ1F超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；CO2孵箱(三洋公司)，FACScan型流式细胞仪(FCM,美国Becton Dickion公司) 实验方法 细胞培养 将pc3m置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，37℃、体积分数5% CO2饱和湿度培养箱培养,细胞呈单层贴壁生长后取对数生长期细胞用于实验。 细胞抑制率检测 采用MTT法。取生长良好的pc3m细胞,调整细胞浓度至1～2×104个/ml接种于96孔培养板内,待细胞贴壁后实验组分别加入、、、、和 mg/ml的苦参碱，空白对照组不加药物。每组设3个复孔,放入CO2培养箱内培养24 h,然后每孔加MTT溶液20 μl(5 mg/ml),再培养4 h,弃上清,每孔加入100 μl DMSO振荡,使结晶完全溶解,在全自动酶标仪上比色,空孔对照调零于酶标仪上测定吸光度值(A值), 计算 不同浓度苦参碱作用后细胞生长抑制率,实验重复3次,取3次平均值。细胞生长抑制率(%) =(对照组A值-加药组A值) /对照组A值×100% 细胞凋亡率检测 以不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化收集经过不同浓度苦参碱处理的pc3m细胞1～2×106，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次（2 000 min，5 min），加入500 μl的binding Buffer悬浮细胞，加入5 μl Annexin VFITC混匀后加入5 μl PI混匀，室温避光反应5～10 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。 细胞OPN mRNA表达检测 采用RTPCR方法。 组织总RNA抽提和cDNA合成 用Trizol一步法提取总RNA,UV2201型紫外分光光度计上测定OD260和OD280,换算pc3m细胞中总RNA纯度和浓度,琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。实验组与对照组分别取2μg总RNA,采用RTPCR扩增试剂盒,合成cDNA模版。 PCR 各样品分别取1 μl逆转录产物进行PCR。加入目的基因OPN引物。OPN上游引物5′CCCTTCCAAGTAAGTCCAACGAAAGCC 3′;下游引物:5′GCTGACTCGTTTCAT AACTGTCCTTCCC3′;预计扩增片段长度470 bp。PCR扩增条件为：℃ 2 min，℃ 30 s、℃ 15 s、72℃ 30 s共32个循环，72℃ 10 min，扩增产物加入%琼脂糖凝胶中,以120 V/cm电泳30 min后,在320 nm紫外透射仪下观察相应的目的基因的扩增条带。 统计学方法 采用统计软件，结果以x±s表示。采用方差分析和t检验。 2 结 果 细胞抑制率 苦参碱、、、、和 mg/ml组细胞增殖抑制率分别为%、%、%、%、%和%。随苦参碱作用浓度的增加,细胞增殖逐渐减慢。苦参碱对细胞增殖的抑制率随药物浓