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人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定 1 1 材料与方法 2 2 结 果 4 3 讨 论 4 文2：人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定 5 1 材料与方法 6 2 结果 9 Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学鉴定 9 3 讨论 10 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定 文1：人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定 【Abstract】 Objective To explore a method of the isolation, culture and identification of human fibroblasts (hFbs) in vitro for the provision of seed cells in tissue engineering skin. Methods The cells were cultured and expanded and observed under phase contrast microscope, and they were identified with immunocytochemistry and flow cytometry (antivimentin, cytokeratin 15). Results With phase contrast microscope, the cells were observed to uniformed population of cells and fibroblastlike. Immunocytochemistry and flow cytometry showed all cultural cells were fibroblasts (positive for vimentin, negative for cytokeratin 15). The cells were subcultured 6 generatio. Conclusio A method for isolating and culturing hFbs in vitro is established successfully. 【Key words】 Fibroblasts;Isolation;Culture;Identification 成纤维细胞是构成皮肤真皮的主要细胞，其正常的增殖、分化维系着皮肤正常的结构和生理功能。本实验旨在探索一种简单、高效分离培养人真皮成纤维细胞(human fibroblasts，hFbs)的技术方法，为进一步利用组织工程学构建复层皮肤奠定基础。 1 材料与方法 主要试剂 DMEM/F12(Gibco)，优等胎牛血清，DispaseⅡ(Roche)，胰蛋白酶(Sigma)，Triton X100(Sigma)，鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(Santa)，兔抗人角蛋白15单克隆抗体(Abcam)，免疫组化SP试剂盒(迈新)，DAB显色液(迈新)，FITC标记的抗鼠和抗兔IgG(北京中杉) hFbs的分离培养 原代培养 取包皮环切术的正常皮肤组织，用含青链霉素的PBS冲洗3次，尽量去除皮下结缔组织;将皮肤剪成小块，真皮面朝下平铺于平皿中，加入DispaseⅡ4℃条件下过夜;次日分离表皮真皮，将真皮剪切成小块，接种于35 mm培养皿中，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养1 h，加入少量含10%优等胎牛血清的DMEM/F12(3∶1)，次日加入足量培养基继续培养，以后每3 d换一次液。 传代 用%胰酶%EDTA消化约1 min，在显微镜下观察细胞回缩变圆、细胞间隙增大后，加入含10%优等胎牛血清的DMEM/F12(3∶1)终止消化，用吸管吹打细胞，以1∶3比例传代培养。 形态学观察 利用倒置相差显微镜观察细胞生长情况及形态变化。 免疫细胞化学 取爬片的P6代细胞，PBS清洗3次，4%多聚甲醛室温固定20 min;PBS清洗，%Triton X100孵育10 min;3%的过氧化氢室温阻断20min;PBS清洗，血清覆盖20 min;稀释度为1∶100的鼠抗人波形蛋白(Vimentin)一抗和兔抗人角蛋白(Cytokeratin，CK)15一抗4℃过夜;PBS清洗，加入二抗室温孵育30 min;PBS清洗后加DAB，苏木素复染;同时用PBS代替一抗作阴性对照，显微镜下观察照相。 流式细胞术 用%胰酶%EDTA消化收集P3和P6代细胞，使其细胞数为2×105个/每例样本;PB