细胞生物学第2章-方法.ppt

Figure 3-8. Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrula-stage Drosophila embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocal image (B), this out-of-focus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the embryo. 共聚焦显微镜拍摄 的紫茉莉花的雄蕊 电子显微镜的基本原理是在一个高真空的系统中，由电子枪发射电子束，穿越被观察的样品或者利用样品表面反弹的电子成像，经电磁透镜聚焦放大后，在荧光屏上显示出图像，或者采用感光胶片等方法记录观察结果。 （二）、电子显微镜 与光镜的基本区别： 构成上：光源为电子束（小于0.1nm），使用电磁透镜，镜筒中要求高真空，图像通过荧光屏观察或者感光胶片记录。 分辨率上：最高0.2nm，有效放大倍数106倍。 只能在电子显微镜下观察到的结构称为亚显微结构（超微结构）。 电子显微镜的基本结构和成像原理 实际放大倍数为4500倍时， 由光镜和电镜拍摄的图像中 所含信息的比较 （a）1um厚的骨骼肌组织在 光镜油镜下拍摄的图片 （b）0.025um厚的同样组织 切片在相同倍数的电镜下观 察的结果，分辨率增加1-200倍 透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM） 利用透过样品的电子形成图像，在观察细胞内部超微结构方面应用广泛。 扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM） 利用样品表面反弹的电子成像，主要用于观察物体的表面结构，包括样品表面形貌特征、管腔内表面结构的观察和分析。 1. 透射电子显微镜 放大倍数在1000-250000倍之间，分辨极限为3~5埃。透射电子显微镜要求的观察样品极薄，厚度约70nm，当电子束打在样品上时，一部分电子可以穿越样品，形成透射电子，经成像系统转换为样品图像。 TEM电镜制样技术： (1)超薄切片技术:厚度40-50nm 固定—包埋—切片—染色 超薄切片制作流程 (2) 冷冻超薄切片技术 可以保存可溶性物质和生物大分子的活性（尤其是酶），能够在分子水平上研究细胞的超薄结构。 样品放置在液态丙烷（-42℃）或液氦（-273 ℃ ）冷却的金属块上，快速冷冻，冰晶没有时间生长到明显破坏细胞结构的程度。 (3) 冷冻蚀刻电镜技术 通过样品迅速冷冻和低温下断裂，观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。样品可不经包埋和固定处理。 核孔 核膜 线粒体 冷冻断裂复型形成的过程 断裂 蚀刻 投影和复型 氟利昂 从正上方垂直 在金属层上沉积碳 在断裂面上沉积重金属 （4）负染技术： 采用重金属盐对铺展在载网上的样品进行染色，主要用于显示纯化的细胞组分的精细结构，分辨率可达1.5nm。 家蚕细小病毒负染色电镜照片 2. 扫描电子显微镜： 扫描电子显微镜采用的是极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，通过对次级电子的收集和信号转换，显示出与电子束同步的扫描立体图像，反映了标本表面5~10nm深度的结构信息。 制样不需要切片和染色。 为防止样品在干燥中变形，常用CO2临界点干燥法，样品观察前要用镀金（一般是金或金-钯合金）的方法使标本导电。 观察样品的大小范围从病毒到昆虫的头部，一般放大为15-150000倍，分辨率3nm。 扫描电镜原理示意图 扫描电镜下的四膜虫 Figure 3-23. Scanning electron microscopy. Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A). For comparison,