重组酵母发酵生产门冬胰岛素纯化方案.pdfVIP

重组酵母发酵生产门冬胰岛素纯化方案 一、设计背景 随着我国经济水平的发展，生活环境的不断改善，饮食习惯也有着显著的变化，然而， IDF 2015 糖尿病越来越成为一种常见的代谢疾病。根据国际糖尿病联合会 （ ）在 年公布 的信息来看，目前全球的糖尿人已经超过4.15亿人，预算以后的25年，人数将会逐渐增 6 加，突破 亿人次，随着人数的增加，胰岛素的市场需求也同步增长。目前，每年的胰岛 素需求量已超过 16000kg。在临床上，我们将糖尿病分类为 型糖尿病I (Type I diabetes Mellitus.T1am)和II 型糖尿病(TypeII diabetesmellitus.T2DM)。 1921 Banting 年 第一次将胰岛素提取出来用于糖尿病患者医疗以来。胰岛素成了唯一 β 可降低体内血糖的激素，当人体胰脏内的胰岛 细胞受损，胰岛素不足以调控血糖时，就 需要外源性胰岛素。动物胰岛素、重组人胰岛素、德谷胰岛素以及胰岛素类似物都称之为 外源性胰岛素。具有广泛的前景。动物胰岛素的原材料比较受限，在临床应用中也容易过 敏，出现免疫反应；重组人胰岛素技术成熟，但起效时间长，半衰期短，病人的依从性比 较低。 门冬胰岛素是由丹麦NovoNordisk 研发的一种新型速效胰岛素类似物。将人胰岛素 B 28 （图2） 链第 位脯氨酸替换为天门冬氨酸，来阻断胰岛素链之间的相互作用，从而 减少胰岛素分子之间的聚合能力。使得六聚体复合物快速分解成单体，使其胰岛素加快起 效时间，发挥将糖的效果。 门冬胰岛素是由诺和诺德公司于2000年生产上市。用基因重组的方法将人胰岛素链 的第28位脯氨酸替换成天门冬氨基酸，使胰岛素单体聚合能力下降，加速六聚体复合物 的解离，从而加快起效时间。 INA 的探索是当今生物领域的热点，日益受到重视。它将可能成为人类探索生命奥 秘的重要突破。 为了获得高纯度的门冬胰岛素，本设计方案采用离心除去菌体等前处理方法，利用离 子交换层析技术，实现了方便、快捷、经济的分离纯化INA。 二、设计依据 目前常用的胰岛素从来源上分，可以分为三大类：动物来源的胰岛素 （猪胰岛素和牛 胰岛素），人胰岛素 （半生物合成胰岛素和基因重组人胰岛素），胰岛素类似物。 其中动物胰岛素在原料上容易受限，临床应用易产生交叉免疫反应；人胰岛素虽然技 术成熟，但起效时间长，体内半衰期短，依从性差。考虑到两种来源胰岛素的短板，本方 案从来源点出发，采用酵母表达的发酵方式提供发酵液，运用离子交换层析(IEC)的方法， 提取胰岛素类似物(门冬胰岛素)，从而达到分离纯化的目的。 工程酵母菌规模化发酵，离心收集发酵液上清，经UniGel-80SP 离子交换层析分离后 收集活性峰，送检，纯度应大于90%，酶切，调沉，分装冻干即成制剂。 考虑到门冬胰岛素的等电点约8，样品的pH 应该要低于等电点。所以选择阳离子交 换层析介质来纯化样品。本设计方案依据 《中国药典》2020年版、《药品生产质量管理规 范》和企业标准共同制定。 三、纯化方案 （一）纯化工艺流程图 图1.提取工艺流程图 （二）材料、试剂及设备 1.样品：珠海冀百康生物科技有限公司发酵部门发酵培养的INA 发酵液。 2.仪器设备与试剂 高速冷冻离心机 （湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；紫外检测仪 （上海琪特分析 仪器有限公司）；φ6.5×90×1cm 层析柱 （上海琪特分析仪器有限公司）。 主要试剂：柠檬酸三钠、氯化钠 （西陇科学股份有限公司），试剂均为分析纯。 （三）门冬胰岛素的纯化步骤 1.发酵液的预处理 （1）准备相关仪器、试剂，如烧杯、玻璃棒、量筒、滤网、PH 计等。 2 （）取适量发酵原液，倒入烧杯，加试剂进行初步处理，玻棒搅拌至完全溶解。调 好相应PH，配平装入离心瓶，放高速冷冻离心机离心收集上清