生物制药工艺学：第三章细胞工程.ppt

细胞工程 广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术. 狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。 主要研究内容 动植物细胞与组织培养； 细胞融合； 克隆技术 染色体工程； 胚胎工程； 干细胞与组织工程 第一节 动植物细胞与组织培养 细胞培养（cell culture）和组织培养（tissue culture）都属于体外培养(in vitro culture)，是指生物细胞和组织在离体条件下的生长和增殖，是细胞工程的最基本技术。 动物细胞的培养过程 动物组织细胞培养要求 体外培养特点: 大多数动物细胞要附在物体上表面生长，动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血清。 对环境适应性差，对环境敏感，包括：PH、溶解氧、温度、剪切力等比微生物要求更高。 1.2 植物细胞培养的应用和概念 定义：以植物细胞为单位应用细胞生物学分子生物学的理论和技术，在离体条件下培养、繁殖和精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿改变，从而改良品种、加速繁殖或得到有用的物质的一门科学技术。 植物细胞的全能性（Cell Totipotency）：指任何具有完整的细胞核的活植物细胞，都携带一套完整的基因组（染色体），并具有发育成为完整植株的潜在能力。 植物细胞表达全能性大小排列是：受精卵、生殖细胞、体细胞 植物细胞全能性高于动物细胞，而生殖细胞全能性高于体细胞，在所有细胞中受精卵的全能性最高 植物细胞大规模培养系统（方法） 1.成批培养法：将培养基一次性加入培养器中，接种、培养、收获细胞。 2.半连续培养法：在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换。 3.连续培养法：在反应器中投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定。生长速度取决于基质的浓度（Monod公式）。培养时间长，无菌技术要求高。细胞的生长速度是由限制营养物质的平衡水平决定的。如：烟草细胞 4.固定化培养法：植物次级代谢产物的累积主要在细胞生长的稳定期，细胞成块趋于分化时，细胞中各个细胞处于一定理化梯度下。 固定化反应器：网状多孔板；尼龙网套；中空纤维膜 优点：细胞位置固定，易于获得高密度细胞群及维持细胞间理化梯度，利于细胞组织化，易于控制培养条件及获得较高含量的次级代谢产物。 例如：辣椒细胞固定于聚氨基甲酸乙酯泡沫中，维持23天，辣椒素产量较悬浮培养高1000倍。 胡萝卜的组织培养流程 组织培养基的成分 第二节 细胞融合 细胞融合：是指不同的细胞在离体条件下接触，用无性的方法使其成为一体而产生杂种细胞的技术。 植物细胞和微生物细胞常因有细胞壁不能直接用于融合，须经酶法除去细胞壁而得原生质体而后再进行融合，又称原生质体融合。 动物细胞融合 细胞融合的方法 1）生物学法：采用病毒促进细胞融合。如仙台病毒、疱疹病毒、天花病毒等—含有细胞表面受体结合位点，促使不同细胞凝聚。 2）化学融合法：采用化学融合剂使细胞融合。如PEG（聚乙二醇）、DMSO（二甲亚砜）、甘油酸酯等；---细胞膜中磷脂的酰键及极性集团发生结构重排。 3）电融合法：电场脉冲刺激，使细胞膜表面氧化还原电位发生改变，通透性增加，促进融合。 植物的有性生殖和发育过程示意图 桃、李等植物，每个子房中只有一个胚珠，因此每个果实只有一粒种子。 西瓜、番茄、蚕豆等植物，每个子房中有多个胚珠，因此每个果实就有多粒种子。 威尔穆特领导培育的世界上第一只体细胞克隆动物-克隆羊“多利”于1996年7月5日出生，于2003年2月因肺部感染而死亡。 杂交瘤技术原理简述 动物免疫 动物体内的B 淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下, 可以大量增殖变成浆细胞, 以分泌针对该抗原的抗体。 这种抗体具有特异性, 动物免疫作用就是用特定的外来抗原对动物进行一次或多次免疫,以刺激其能分泌对于该抗原的B 淋巴细胞大量增殖, 从而得到大量产生专一反应的B 淋巴细胞。 细胞融合 B 淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体, 但在体外存活时间很短（最多两周）后即死亡。 而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白, 却能在体外长期存活。 如果将这两种细胞的特性结合起来, 就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。 然而在杂交过程中必然将产生混合物, 因此就需要进一步筛选出其中唯一有用的杂交瘤细胞。 杂交瘤细胞的筛选 杂交瘤细胞由于继承了B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性。 能够合成HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）和TK（胸腺嘧啶激酶）, 故在HAT (H-次黄嘌呤、A -氨基喋呤、T-胸腺嘧啶)培养基中可长期存活。 在历经2 周