第3章细胞生物学研究方法.pptVIP

1932年德国学者Max Knolls和Ernst Ruska用波长比光短得多的电子作光源,发明了第一台电子显微镜，大大提高了显微镜的分辨率，开拓了超微世界。 光学显微镜中观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构称为亚显微结构（submicroscopic structure）或超微结构（ultra structure）。 二、电子显微镜 1.基本构造: (1)电子枪：包括灯丝阴极和阳极。阴极电压50~120KV，阳极0V，两极电压差为加速电压。电子束波长与加速电压的平方根成反比。 (2)电磁透镜：改变电子方向。 (3)真空系统：保持电镜真空。 (4)照相系统： （一）电子显微镜的基本知识 显微镜 分辨本领 光源 透镜 真空 成像原理 光镜 200nm 可见光 （400-700nm） 玻璃 透镜 不要求真空 利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化 电镜 0.1nm 电子束 （0.01-0.9nm） 电磁 透镜 1.33x10-5～1.33x10-3Pa 利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差 2.电镜与光镜的比较 显微镜成像的基本要素有哪些? 电镜与光镜光路图比较 透射电子显微镜 (1)透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM) 3.电镜的类型 (2)扫描电子显微镜（Scanning electron microscope，SEM） ????????????????????????????????????????????????????Figure 3-32. Cells in culture. Scanning electron micrograph of rat fibroblasts growing on the plastic surface of a tissue-culture dish. 20世纪60年代问世，利用二次电子信号成像来观察样品表面形态。 工作原理：电子束扫描样品，在样品表面激发出二级电子，由探测器收集，信号经放大后在荧光屏上显示出与电子束同步的扫描图像。 分辨率为6~10nm，有效放大倍数为0.2mm/10nm=20000X。 (3)扫描隧道显微镜(scanning tunnel microscope, STM) Binning 和Rohrer1981年发明，1986年获诺贝尔物理奖 根据量子力学的隧道效应原理制成，分辨本领高，可在真空、大气、液体等多种条件下工作，非破坏性测量。是纳米生物学研究领域中的重要工具,可在原子水平上揭示样本表面的结构。 扫描隧道电镜下的DNA双螺旋 1.超薄切片技术 （二）电镜制样技术 2.负染色(negative Staining)和投影(shadow casting)技术 (1)负染色:使整个载网都铺上一层重金属盐,而凸出的样品则没有染料. (2)投影技术:又叫喷镀技术,增强背景和待观察样品反差. 3.冰冻蚀刻( freeze-etching)冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。 快速冷冻深度蚀刻技术(A Yeast Cell) 4.电镜三维重构技术英国生物物理学家A.Klug提出,获得1982年诺贝尔化学奖。电子显微术、电子衍射与计算机图像处理相结合，分析难以形成三维晶体的膜蛋白、蛋白-核酸复合物等大的复合体。 Three-dimensional reconstruction from serial sections. 1、离心机: 低速离心机：转速10,000r/min 高速离心机：转速为10,000~25,000r/min 超速离心机：转速25,000r/min。 目前超速离心机的最高转速可达100,000r/min 一、细胞器与生物大分子的分离 第二节 细胞组分的分析方法 Low speed High speed Differential centrifugation  （1）特点： 介质密度均一； 主要根据被分离物质的体积差异； 速度由低向高，逐级离心。 （2）用途：初步分离大小相差悬殊的细胞和细胞器，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。 2、差速离心 （Differential centrifugation） 3、密度梯度离心（density gradient centrifugation) 介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，待分离的各组分分别停留在介质的密度不同的层面。 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 类型： 速度沉降 密度沉降 Figure 3-36. Comparison of methods of veloci