西瓜枯萎病抗性鉴定技术方案.docxVIP

PAGE PAGE 1 西瓜枯萎病抗性鉴定技术方案 西瓜枯萎病抗性鉴定技术方案2871〔2021〕01-076-03西瓜是一种重要的葫芦科园艺作物，每年全球西瓜种植面积约350万hm2，总产量约 10 000万t[1]。我国是最大的西瓜生产和消费国，每年西瓜的种植面积约180万hm2，总产量约 7 000 万t〔 ：//faostat.fao.org〕。西瓜在我国农业结构调整和农民增收中发挥着重要的作用。西瓜枯萎病是由西瓜枯萎病菌〔Fusarium oxysporum f. sp. niveum〕侵染引起的一种在世界范围内广泛发生的真菌土传病害[2]，主要通过土壤传播，也可由种子传播，严峻危害西瓜生产，导致西瓜产量严峻下降甚至绝产[3]。目前，西瓜枯萎病菌有4个生理小种：生理小种0，1，2和3，不同的生理小种可通过特定的鉴别寄主鉴定[4]。抗病品种选育是防治枯萎病危害的经济有效的途径。基于此，笔者依据西瓜枯萎病的生物学特征，结合已有的讨论基础制定了西瓜枯萎病抗性鉴定技术方案，该方案经多次应用验证，适合于西瓜枯萎病的抗性鉴定，为抗病种质的筛选提供可靠的参考根据。1 西瓜枯萎病病害症状西瓜枯萎病在全生育期均可发病，在幼苗期发病较少，幼苗出土后，主要表现为茎基部变褐缢缩，子叶萎蔫下垂，幼苗猝倒，而后干枯死亡。多数病株从伸蔓期至果实膨大期发病，萎蔫枯萎是田间的典型症状，病株叶片自下而上渐渐萎蔫，似缺水状，病情进展缓慢时，植株午间萎蔫，晚上渐渐恢复，几次反复后病株不再恢复常态，萎蔫枯死，叶片不脱落，病情进展快速时，叶片和茎蔓可突然由下而上全部萎蔫。病株的根部变褐腐烂，简单拔起，茎基部常纵裂，裂口处有褐色胶状物，剖视病蔓基部，可见维管束变为褐色。在潮湿条件下，病部可产生白色或粉红色霉状物。在团棵期，部分病株表现为植株生长缓慢、苗小、蔓细和叶瘦小发黄，茎部维管束变褐，雨后常出现裂茎，植株为畸形的小老苗[5-6]。2 西瓜枯萎病病原菌的分别与鉴定2.1 病原菌分别纯化接受组织分别法分别病原菌[7]。在西瓜枯萎病发生地块，采集西瓜病株茎基部组织，2～3 cm，流水冲洗，用 75%乙醇消毒 30 s，用无菌水清洗 3～5 次，去除茎表皮，切成1～2 mm薄片，轻轻按压贴于 PDA 培育基〔马铃薯葡萄糖琼脂培育基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉 15 g、蒸馏水 1 L〕外表，25 ℃，恒温条件下培育 3～5 d，长出真菌菌落后挑取边缘菌丝再进一步纯化。若无其它杂菌，扩繁后则可制备孢子悬浮液。西瓜枯萎病菌孢子悬浮液制备方法：在固体培育基上挑取 1个 0.5 cm2 菌片放入200 mL PL培育基〔配方为：1 000 mL 水，马铃薯 200 g，乳糖 20 g〕中，于摇床中 25 ℃、110 r·min-1 培育 5～7 d，将菌液用灭菌的4层纱布过滤，用血球计数板记数并调整孢子浓度为5×106个·mL-1。2.2 病原菌鉴定形态学特征：病原菌在 PDA 培育基上呈白色菌丝、随着生长中间呈粉红色、淡红色、淡紫色、紫红色等，菌落圆形，菌丝绒毛状〔图1-A〕。大型分生孢子为镰刀型，有 3～5个分隔，以3个分隔为主〔图1-B〕[10];小型分生孢子，椭圆形，0～1个分隔，以无隔为主〔图1-C〕;分生孢子梗短、生于菌丝侧面，单生，无分枝;厚垣孢子顶生或间生，圆形，多为单独生长，间或也对生或串生[8-10]。分子生物学鉴定：将病原菌接种于PL液体培育基，在25 ℃、110 r·min-1条件下振荡培育3～4 d，过滤收集菌丝体，根据真菌基因组DNA提取试剂盒提取病原菌DNA，用真菌通用引物ITS1/ITS4〔ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC〕对病原菌 rDNA 的 ITS 区域进行 PCR 扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收、测序，将该序列提交至 GenBank，通过 BLAST进行序列比对，分析待检菌株与Fusarium oxysporum同源性[10]。病原菌回接试验：确保分别的菌是西瓜枯萎病病原菌，完成柯赫氏法则。生理小种鉴定：西瓜枯萎病菌生理小種鉴定接受Sugar Baby〔或 Black Diamond〕，Charleston Gray，Calhoun Gray 和 PI296341-FR 作为一套鉴别寄主，生理小种划分标准见表 1[4]，接种鉴定技术详见枯萎病苗期人工接种鉴定：3 西瓜枯萎病苗期人工接种鉴定3.1 接种方法3.1.1 壮苗培育 西瓜种子消毒催芽，1.5 %次氯酸钠溶液消毒20 min，中间翻动1次，消毒结束后用流水冲洗洁净，浸种12 h，用湿毛巾包好在30 ℃恒温箱中催芽，当80%以上的