二十碳五烯酸对人肝癌HepG2凋亡细胞线粒体的影响.doc

二十碳五烯酸对人肝癌HepG2凋亡细胞线粒体的影响 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：二十碳五烯酸对人肝癌HepG2凋亡细胞线粒体的影响 1 1材料和方法 2 文2：二十碳五烯酸对人肝癌HepG2凋亡细胞线粒体的影响 6 1材料和方法 6 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 二十碳五烯酸对人肝癌HepG2凋亡细胞线粒体的影响 文1：二十碳五烯酸对人肝癌HepG2凋亡细胞线粒体的影响 二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid， EPA）属于n3多不饱和脂肪酸（n3 polyuaturated fatty acid，n3PUFA），主要存在于深海鱼油中，是一类对人体有益的重要营养素. 近来的研究表明n3PUFA可以抑制肿瘤细胞增殖，具有一定的抗瘤功效［1］，其中诱导肿瘤细胞凋亡可能是主要机制之一［2］. 有研究发现，EPA可以通过p53依赖，Fas介导途径诱导人肝癌HepG2细胞凋亡［3］. 我们采用DNA梯形带检测， MTT比色法和激光扫描共聚焦显微镜检测等方法，通过观察EPA对体外培养的HepG2细胞凋亡和线粒体的影响，初步探讨线粒体损伤在EPA诱导HepG2细胞凋亡过程中所发挥的作用，为进一步研究n3PUFA在抗肿瘤方面的功效提供一定的理论基础。 1材料和方法 材料人肝癌HepG2细胞购自中国科学院上海生化与细胞所；DMEM培养基购自美国Gibco公司；EPA，四唑盐（MTT）购自美国Sigma公司；线粒体荧光探针MitoTracker Red购自美国Molecular Probe公司；小鼠抗人Caspase9 mAb为美国NeoMarker公司产品；Caspase9蛋白酶特异性底物AcLEHDAMC 为美国Alexis公司产品。 方法 mL/L小牛血清的DMEM培养液. 试验分为：处理组HepG2细胞于对数生长期应用EPA（终浓度为120 μmol/L培养液）处理24 h后收获；对照组采用正常培养未经EPA处理的HepG2细胞。 ×106个细胞，PBS洗涤细胞2次，加150 μL NP40裂解液裂解细胞5 h，离心收集上清，150 μL NP40细胞裂解液重复抽提沉淀1次，将上清置于等体积10 g/L SDS溶液中并混匀，加入RNase A（终浓度为2 μg/mL），56℃孵育2 h，加蛋白酶K至终浓度为2 μg/mL，37℃水浴2 h，加1/2体积的10 mol/L醋酸铵和2倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃过夜，4℃高速离心30 s，弃上清，750 mL/L冰冷乙醇漂洗沉淀，20 μL TE缓冲液溶解DNA，取5 μL DNA进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳。 ，处理组细胞经终浓度为120 μmol/L的EPA处理24 h后收获. 两组细胞用无血清培养液冲洗1次，加入线粒体探针MitoTracker Red（无血清培养基1∶5000稀释） 37℃孵育40 min，无血清培养液冲洗3次，应用激光共聚焦显微镜，绿色激发光激发下观察并照相。 ［4］HepG2细胞传代后培养于6孔板中，每孔×106个细胞，每组设3个复孔. 两组细胞用不含血清的培养液清洗，每孔加入100 μL MTT（5 g/L浓度溶解于PBS中），37℃孵育1 h，弃上清液，每孔加入3 mL细胞裂解液， 570 nm处测量A值. 两组以相同方法重复检测3次。 ×107个，加入100 μL冰预冷的NP40细胞裂解液（50 mmol/L， pH Tris?Cl， 150 mmol/L NaCl，25 mmol/L NaF，5 mmol/L Na4P2O7-，1 g/L SDS，1 mmol/L PMSF，10 μg/mL Aprotinin，10 μg/mL Leupeptin，10 g/L NP40）冰上静置裂解30 min，4℃， 12 000 g离心15 min，收集上清，brodford法测定蛋白含量. 取20 μg蛋白，用细胞裂解液稀释至20 μL，加20 μL 2×SDS凝胶加样缓冲液，煮沸5～10 min，100 g/L SDSPAGE电泳，电转移至PVDF膜，10 g/L BSA室温封闭1 h，然后加入小鼠抗人Caspase9 mAb（1∶100稀释）37℃孵育1 h，使用羊抗鼠SP试剂盒反应，DAB显色。 ［5］两组均收获约1×106个细胞，PBS洗涤2次，离心弃上清，加入500 μL细胞裂解缓冲液（10 mmol/L， Tris，30 mmol/L NaCl，10 mmol/L NaF，10 mmol/L NaPi，10 mol/L NaPPi，10 mL/L Trion X100）轻柔重悬细胞沉淀后