蛋白质组学及其研究方法.pptVIP

2-DE分析的基本步骤 蛋白质 溶解 变性 还原 去除蛋白 质杂志 利用不同 pK固定化 电解质可 配置不同 pH范围的 凝胶或利 用商业化 软件设计 第一相电泳： IPG－IFE 平衡 第二相电泳： SDS－PAGE 考马斯亮 蓝染色、 银染色、 铜染色 样品制备 IPG胶制备 双相电泳 染色 第21页，共47页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 2-DE的操作 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSSDS polyacrylamide gel electrophoresis SDS带负电荷，破坏蛋白质的氢键、疏水键，使之形成单个亚基。 SDS-蛋白质复合物为雪茄形的长椭圆棒，消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。 SDS -蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率只是蛋白质分子量的函数有关。 第22页，共47页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 制胶： 试剂 分离胶（ml） 浓缩胶（ml） 1.5M Tris-HCl （pH 8.9） 2.50 —— 30%单体 3.50 1.00 10%SDS 0.10 0.10 蒸馏水 3.84 6.34 0.5M Tris-HCl （pH 6.8） —— 2.50 10%过硫酸铵AP 0.05 0.05 四甲基乙二胺TEMED 0.01 0.01 第23页，共47页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 样品处理： Loading buffer 40%甘油 溴酚兰 SDS β-巯基乙醇 0.5M Tris-HCl（pH 6.8） 50ul样品 50ul(2×)Loading buffer Mix 950C/5min 第24页，共47页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 电泳槽 上电极缓冲液 下电极缓冲液 样品槽 上样器 阴极 阳极 电泳 方向 聚丙烯酰胺凝胶板 第25页，共47页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 第26页，共47页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 蛋白质点的染色 凝胶上的蛋白质点染色常用方法有银染法、考马斯亮蓝染色法, 另外还采用以下染色试剂:丽春红S、氨基黑、印度墨、35S 硫脲银、胶态金、咪唑锌等. 银染法广泛用于双向凝胶电泳分离后蛋白质点的染色, 该法灵敏度为4 ng , 但对质谱测定有干扰, 必须先脱银. 考马斯亮蓝染色法可用于胶上或膜上蛋白质点染色, 该法操作方便、重现性好, 同银染法一样, 质谱测定时也必须先脱色. 第27页，共47页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 2-DE图像分析技术 通过2-DE得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或 扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和 一定边界方向的斑点电脑信号。 2-DE获得的蛋白质图谱 第28页，共47页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 图像采集 斑点检测 背景消减 获得蛋白质相关信息 图像内及图像间的比较 2-DE图像分析软件包操作过程： 第29页，共47页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 2-DE技术的优缺点 优点：可以同时直观显示数千个蛋白质点； 缺点： 极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离； 胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化； 丙烯酰胺有神经毒作用。 第30页，共47页，2022年，5月20日，4点49分，星期六 新型非凝胶技术 液相色谱法(liquid chromatography，LC) 毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE) 液质联用技术（LC-MS/MS） 蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE的分离，然后进入MS系统获得肽段分子量，再通过串联MS技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。 多维色谱技术（LC/LC-