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抗肝纤维化佤族用药筛选研究 　　摘要：目的研究佤族肝病用药针对肝星状细胞hsc-t6增值和活力的影响从而筛选出有效的抗肝纤维化药物。方法采用celigocytomter全视野细胞扫描分析仪，直接对健康生长条件下空白组及分别以不同浓度给予等量不同药的给药组肝星状细胞进行分析，通过对细胞增值和活力的观察分析，筛选出具有显著抑制肝星状细胞增值的药材。结果给药组肝星状细胞hsc-t6的细胞数目少于空白组肝星状细胞hsc-t6的细胞数目。结论佤族肝病用药对肝星状细胞有一定的抑制作用。 　　关键词：佤药;肝纤维化;肝星状细胞;筛选 　　中图分类号：r29文献标志码：a文章编号：1007-2349（2020）02-0087-03 　　 　　肝纤维化（hepaticfibrosis，hf）是各种慢性肝病发展为肝硬化的共同病理过程和发展途径，是肝脏对各种损伤所产生的一种修复反应，其主要特征表现为肝星状细胞（hepaticstellatecells，hsc）的大量增殖和细胞外基质（extracellularmatrix，ecm）在肝脏内过度沉积特別是胶原的过度合成。在肝纤维化的早期，肝星状细胞由“静止”转变为“活化”的肌成纤维细胞（myofibroblast，mfb），随后活化的肝星状细胞过度增殖并大量合成各种细胞外基质成分[1-2]。肝星状细胞（hsc）是肝纤维化的细胞学基础，是肝纤维化的效应细胞，也是细胞外基质的主要产生细胞，其活化是肝纤维化形成的开端[3-4]。因此，临床主要通过抑制hsc活化和促进hsc凋亡来逆转肝纤维化的进程。在前期调研过程中，课题组发现佤族药治疗肝病具有本民族的特色和优势，近些年已在单味中药、单验方等方面取得了一定的进展。在佤族地区，民间佤医非常注重鲜品药物（以植物药为主）的使用，在使用鲜品药物中常用的剂型有汤剂、饮剂、外包剂、外搽剂、外洗剂等。肝炎则多用日不给杏、努公把、日不润卜歪、日不安里。德娘百艾（均为佤名）等[5-7]。 　　课题组在实验过程中正是选择了20余种佤族治疗肝病的习用药材，进一步在肝星状细胞hsc-t6上进行验证分析，通过celigocytomter全视野细胞扫描分析仪对健康生长条件下的肝星状细胞以及给药之后的不同时间段的肝星状细胞状态进行观察分析总结，得出最后结论。现报告如下。 　　1材料与方法 　　1.1实验细胞肝星状细胞hsc-t6细胞株购自于中国科学院昆明动物研究所细胞库（编号：kcb200703yj）。 　　1.2实验药物与试剂实验用佤药共26种，随机数字编号为1到26号，批号均购自于沧源县中医佤医医院;中美特级胎牛血清（1829596）、dmem/高糖培养液（0010219）、青霉素-链霉素溶液（1843964）、胰蛋白酶溶液上述试剂均购自云南泽浩商贸有限公司。 　　1.3实验仪器celigocytomter全视野细胞扫描分析仪，美国nexcelom，耐细隆生物仪器（上海）有限公司;真空操作台，airtech;olympusbx600显微镜，奥林巴斯（北京）销售服务有限公司;co2细胞培养箱，美国shellab;dlab离心机，型号：dm0412，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司;超纯水系统，英国elgaclassicuf;-80℃超低温冰箱，ermofisher;tgl16m冷冻高速离心机eppendow。 　　1.4药材前处理随机抽选编号5，8，10，23，24共5种药材每种各100g，按1：10的比例加水，煎煮30分钟，滤出药液。取药渣再按上述方法提取两次，合并三次滤液，浓缩滤液至20ml，放于-20℃冰箱保存备用。最后药物浓度为1g/ml的原液，在80℃水浴30分钟、连续3天高温灭活后，1000rpm离心10分钟，-20℃冻存备用。实验时临用时用dmem培养基溶解药物为20mmol/l母液浓度后，倍比稀释至3个浓度（200、400、800μg/ml）三组备用。 　　1.5受试药材对hsc-t6细胞增殖和细胞活力的影响将hsc-t6细胞消化传代，取对数生长期的hsc-t6细胞，将每组细胞以1×104个/孔接种于96孔板中。然后放入37℃、5%co2细胞培养箱内培养，24h后分别加入等量受试药材，每种药材分别设3个浓度组（200、400、800μg/ml），用培养基稀释至相应浓度，每组设4个复孔，空白组加入等量培养基，分别在药材刺激后24h，48h，72h取出96孔板，用celigocytomter全视野细胞扫描分析仪检测细胞增值和细胞活力情况，从而评价药物对hsc-t6细胞生长的影响，筛选出对其增殖具有显著抑制作用的药材。 　　1.5统计学