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神经细胞体外培养方法及应用 汕大医学院病理教研室 神经细胞体外培养的历史 神经组织的体外培养方法是由Harrison，于1907年首创的。 由于该方法具有简化细胞生化环境、明确生长条件、便于施加实验因素及容易获得活体直接观测结果等优点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段。 九十余年来，这项技术已从组织块（或植块）培养（explant culture）发展到分离细胞培养(dissociated cell culture)，并逐渐与多种现代技术结合起来，在神经科学各领域发挥了重大作用。 组织块培养→分离细胞培养→甚至单一型细胞培养 神经组织的植块培养法 悬滴培养方法 单盖玻方法 双盖玻方法 1925 改良双盖玻方法 培养物： CNS灰质、白质、外周神经节或神经小段 ↓ ↓ 突起 非神经元外伸 优点 所需培养液量少，可反应组织代谢中 微量生化改变 保留了植块内组织特征 不足 培养空间小，O2 CO2供少 培养空间湿度难以控制，水分会蒸发 密封手续繁杂，不利更换培养液，难 以观察单个神经元生长。 神经元的分离细胞培养方法 1956年，Nakai首创了神经组织的分离培养方法 材料来源：胚胎动物神经组织 神经元增殖发生于胚胎期 形态学分化和化学分化程度低，体外存活强，成熟后则相反，且神经元会受到大的普遍损伤。 部位：灰质、PNS神经节，神经元集中，密度大 神经元的体外培养液 天然合成成分 血清 血浆 胚胎撮液 人工培养基 无血清培养基 化学限定性培养基 常用的：DMEM + 添加剂 F12 ①葡萄糖 为神经元能量代谢主要来源 33mm ②CO2 NaHCO3缓冲系统重要 HEPESO2耗量更高 ③K+ 神经元生理活动的重要离子，K+是神经元存活所必需的，K+ 24.5mM 能提高神经元存活，促分化 ④非神经元成分的抑制 有 2-3天 神经元无血清限定培养液 人工合成的培养基虽然具备了细胞生长的基本营养物质和无机盐类，但仍无法满足不同类型细胞的特殊需要。大多数神经元在基础培养液中即使能够存活也为期不长，更难以分裂。因此可根据神经元的特性，给基础培养中再添加某些特殊物质。 选择添加剂的基本过程 ? 限定连续细胞系的体外生长条件。 试定该细胞系来源的细胞的培养 液条件。 * *