华南师范大学《细胞生物学》课件-第3章细胞生物学研究方法.pptx

1;第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞化学技术 第三节 细胞分选和离心分离技术 第四节 细胞生理学技术 第五节 细胞工程技术 第六节 细胞内生物大分子的动态变化;第一节 细胞形态结构的观察方法;一、光学显微镜技术 (Light Microscopy);? 普通复式光学显微镜术;? 相差显微镜术（Phase-contrast Microscopy）; 在结构上，相差显微镜与普通显微镜的不同点在于：具有环形光阑的聚光镜和带有相板的相差物镜。当光线经过相差聚光镜、样品和相差物镜时，光线分为两部分，一部分为样品结构的折射光，另一部分为不受样品影响的光，经过相板，二者发生互相叠加或抵消的干涉现象，从而表现为肉眼明显可见的明暗区别。;相差、微分干涉、荧光显微镜; 相差显微镜图像的反差是以样品中的密度差别为基础形成的，故其观察的样品不需染色，适用于观察较透明的活细胞或染色反差小的细胞组织。;用相差显微镜观察细胞分裂;?微分干涉显微镜术（Differential Interference Contrast Microscopy）;12;相差、微分干涉、荧光显微镜; 适于研究活细胞中较大的颗粒或细胞器。影像具有很强的立体感。;? 荧光显微镜术（Fluorescence Microscopy）;16;17;18;? 暗视眼显微镜术（Dark Field Microscopy）; 聚光镜的中央有挡光板，使得照明光不能直接进入物镜，只允许被标本反射和折射的光进入物镜形成亮的像。这样就观察到暗背景中发亮的细胞结构。;可观察4～200 nm的微粒子，分辨率比普通光学显微镜高50倍； 适用于观察活细胞以及细胞内微小颗粒，例如线粒体、细菌运动等。 ;? 视频反差增强显微镜术（Video-enhance contrast Microscopy ）;用视频反差增强显微镜观察到的细胞中的微管;? 激光共焦扫描显微镜术（Laser Confocal Microscopy）; 以激光作为荧光的激发光，通过扫描装置对样品进行扫描得到二维荧光影像。物镜后焦面处安装一个光阑，阻挡离焦的影像而只让焦面的像通过，到达光检测器，从而获得焦面的影像。 通过调节物镜就可获得细胞不同切面的影像，计算机重塑就获得细胞的三维图像，因此也称为细胞CT。; 激光共焦扫描显微镜??普通荧光显微镜的用途相同，但其分辨率比普通荧光显微镜提高1.4~1.7倍。用于研究亚细胞结构与组分分析等。 如图：细胞骨架的微管(绿色)和细胞核(蓝色);27;28;二、 电子显微镜技术 (Electron Microscopy);1. 透射电子显微镜（TEM）;电子显微镜与光学显微镜的比较;相同放大倍数下 (4500?) 骨骼肌组织的光镜 (a) 和电镜 (b)下的切片图比较。光镜切片厚1?m，用油浸镜头观察，电镜切片厚0.025 ?m。图中可见电镜切片的分辨率增加100～200倍。;电镜与光镜光路图比较;电子显微镜的基本构造;35;主要电镜制样技术;37;细胞透射电镜照片;烟草花叶病毒的负染色的电镜照片;40;2. 扫描电子显微镜（SEM）;42;T4噬菌体(左)和昆虫头部(右)扫描电镜图;三、扫描遂道显微镜（Scanning tunnel microscope, STM）;45;46;47;第二节 细胞化学技术;一、 酶细胞化学技术;50;二、免疫细胞化学技术;52;53;54;三、分光光度技术;第三节 细胞分选和离心分离技术;57;? 主要应用： ? 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； ? 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； ? 测定细胞群体中细胞凋亡的比例； ? 分离DNA含量不同的中期染色体； ?用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量 。;二、染色体分选;三、离心分离技术;?差速离心：介质均一，速度由低到高，逐级分离，用于分离大小相差悬殊的细胞和密度不同的细胞组分。沉降速度为核——线粒体、溶酶体与过氧化物体——内质网与高尔基体——核蛋白体。 转速为10000～25000r/min的离心称为高速离心，转速25000r/min的离心称为超速离心。 ?密度梯度离心：用介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，细胞悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞或细胞匀浆分层、分离。 用于精细组分或生物大分子的分离。;62;63;第四节 细胞生理学技术;一、膜电位检测技术;66;二、膜片钳技术;