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测试方法的验证 验证含量测定: 高效液相色谱方法HPLC 8. 特定性(Specificity) 验证目的:1. 专一性: 证实没有干扰(Selectivity); 2. 具有稳定性的指示能力 (Stability-indicating) 专一性 /选择性: 样品溶剂, 液相溶剂, 添加剂, 过滤用具 测试方法的验证 验证含量测定: 高效液相色谱方法HPLC 强化分解试验(Stress Study): 条件和所需的降解度 调节强化条件,达到5%-10%分解 无需检测物在各种强化条件下都达到5%-10%的分解 至少应有在一种强化条件下的分解 测试方法的验证 强化分解试验(Stress Study): 加热: 视各原料药的熔点, 不应超过100 °C. 多选用40 °C.和 60 °C. 加热时间不少于24小时. 加热和湿度: 常用条件: 60 °C /75%RH, 40 °C /75%RH. 强化时间 不少于7天. 光照: 按ICH光照条件的要求, 视光照箱辐射能力而定时间. 达到1.2X10 6 Lux 小时或紫外光200瓦小时/平方米的条件 测试方法的验证 强化分解试验(Stress Study): 氧化: 采用 1% -3% H2O2, 在30 °C, 1-24 小时 酸性水解: 可用 0.01N - 0.1N HCl, 在30 °C , 时间视分解程度而异. 碱性水解: 可用 0.01N-0.1N NaOH, 在30 °C , 时间视分解程度而异. 经过酸性或碱性水解后的样品, 需经过中和后再进行色谱分析. 测试方法的验证 分析强化分解的样品 用测试含量和杂质的方法分析同一条件下的分解样品. 检验其方法的选择性,准确性和精确性, 计算含量的降低与所产生的降解产物量是否收支平衡(Mass balance) 列表来总结这些分解样品的测试结果 可接受的收支平衡范围, 如果未能达到,如何进行研究和讨论 测试方法的验证 分析强化分解样品的纯度(Purity) 证实原料药的峰不含其他杂质 必须使用光电子二极管阵列监测器 (PDA, Photodiode Array Detector)分析含量和杂质图谱中的原料药峰 使用光谱特定的软件来计算, Chemstation using Purity and match factor Empower, use a factor 将数据列表, 归纳并作出结论 测试方法的验证 标样和样品溶液稳定性(Sample Stability) 为在测试方法中的信息提供证据 标样溶液稳定性 第一天, 第二天….第N天, 可接受的标准: 99.0%-101.0% 样品溶液稳定性 第一天, 第二天….第N天, 可接受的标准: 原料药为99.0%-101.0% 成品药为98.0%-102.0% 将数据列表,归纳并作出结论. 这结论也写入分析方法中. 注意室温的定义与所在地区的联系 应充分利用HPLC样盘上的制冷装置 测试方法的验证 杂质检测方法的验证 除了需验证含量检测方法的所有项目外, 定量限度(Limit of Quantitation) 在其最低浓度时, 检测物可被准确的,重复的和定量的检测到. 原料药: 0.05%, RSD; NMT 10% 成品药: 0.08% - 0.10%, RSD; NMT 10% 现多用必须报告的限度(Reporting Threshold) 测试方法的验证 如何计算必须报告的限度(Reporting Threshold)? 按ICH指导文件, 如果此药每天最大剂量中的原料药低于或等于1克时, 其必须报告的限度(Reporting Threshold)是0.1%. 任何杂质的含量在0.1%和超过0.1%都必须列出并计入杂质总和. 如果此药每天最大剂量中的原料药 超过 1克时, 其必须报告的限度(Reporting Threshold)是0.05%. (注意必须报告至小数点后两位数) 通常是在分析方法中列出此药必须报告的限度(Reporting Threshold), 但验证方法的定量限度(LOQ)时, 其浓度应低于必须报告的限度浓度. 测试方法的验证 杂质检测方法的验证 检测限度(Limit of Detection) 在其最低浓度时, 检测物可被重复的检测到. 但其含量是不准确的. 按定量限度定义: 信号/躁音(S/N) = 10:1 检测限度的定义: 信号/躁音(S/N) = 3:1, 即检测限度 = 定量限度/3 如果定量限度是0.05%, 那么其检测限度: 0.05% / 3 = 0.017% 测试方法的验证 杂质检测方法的验证 建立已知杂质