第六章兽药残留检测技术苯并咪唑类.pptVIP

Tocco等发现TBZ在尿和奶中的代谢产物主要是5-OH-TBZ与葡糖苷酸和硫酸酯结合物,结合物用β-葡糖苷酸酶/硫酸酯酶或酸(6mol/L盐酸回馏1h)水解,释放出游离的5-OH-TBZ。 Chuckwudebe等对TBZ在蛋鸡和奶牛中代谢产物进行了研究,发现结合物主要是硫酸酯结合物。 Markus等对肝样中的ABZ及其相关代谢物的结合物用酸解方法进行水解,释放出游离的ABZ-NH2-SO2。 Coulet等对组织中的TBZ蛋白结合物用碱解方法水解。 第三十页，共六十六页。 2、提取及净化 液-液萃取(LLP)是提取苯并咪唑类药物的最常用方法,通常将水性溶液调节至适当的pH值,用水不相溶的有机溶剂提取。 用酸溶液提取时,即包括了样品的水解过程。 由于苯并咪唑类药物的极性和pKa差异很大,因此多残留提取相当困难,即使对单一药物,母药及其代谢产物的同时提取亦难。 第三十一页，共六十六页。 例如 MBZ及其两个代谢产物MBZ-OH和MBZ-NH2,由于MBZ和MBZ-NH2呈碱性,pKa分别是3.5和5.5,在pH7.5时,这两种化合物不被电离;MBZ-OH含酸性的-OH,其pKa为9.8,在pH7.8时不被电离。因此,溶液只有在pH7.5~7.8间,所有化合物不被电离,呈中性,这时可用极性溶剂(如:乙腈、甲醇、水-乙腈、水-甲醇等)来提取。 第三十二页，共六十六页。 (1)血浆、血清或其他生物液体 生物体液样品中的苯并咪唑类可用有机溶剂提取,直接进样分析。 Bogan等将血浆样品调节至pH7.4,用乙酸乙酯来提取FBZ、OFZ和ABZ。 Hoaksey等将血浆样品用乙腈脱蛋白,再用二氯甲烷提取ABZ和ABZ-SO。 Alvinerie用乙酸乙酯提取血浆中TCB、TCB-SO和TCB-SO2,以及TBZ和5-OH-TBZ,直接用HPLC-UV测定。 第三十三页，共六十六页。 Allan等将血浆样品用酸性溶液稀释后过C18小柱,依次用20mL水、0.5mL甲醇+水(40+50)和0.4mL甲醇淋洗,最后用1.6mL甲醇洗脱,甲苯达唑及其代谢物的回收率大于80%。 Hennessy等将这一方法用于胆汁中TCB的提取,但样品过柱前先用乙酸乙酯提取,后来也用于血浆样品中ABZ的提取。 自动萃取仪具有省时、省力、重复性高的优点,应用日趋广泛。 Rouan等采用自动萃取仪、C18固相萃取柱提取/净化血浆样品中TCB,回收率可达到90%以上。 第三十四页，共六十六页。 (2)组织 动物组织中的苯并咪唑类提取一般用有机溶剂,并经LLP和SPE净化。 有人采用LLP和SPE相结合方法进行净化,用HPLC-UV检测。也有人采用LLP的单一净化方法,用选择性高的荧光检测或LC-MS/MS检测。 虽然LLP净化方法选择性较差,但适合于苯并咪唑类的多组分提取,而用复杂的净化方法可能回收率较低。 第三十五页，共六十六页。 Brandon等用二甲亚砜-水(10+90)来提取肝组织中的TBZ,在ELISA测定前用PBS稀释。 Brandon等采用类似的方法,用二甲亚砜-水(10+90)提取肝组织中11种苯并咪唑类残留,包括水溶性低的FBZ。 Marti等用乙腈提取肌肉、肝脏、肾脏组织中8种苯并咪唑类残留,提取物用LLP净化,包括正己烷、饱和氯化钠和二氯甲烷洗涤,然后用C18固相萃取柱浓缩/净化,再用HPLC-UV或GC-MS分析,除OFZ外,回收率均在65%以上,OFZ在肝脏和肾脏中的回收率仅为45%和39%。 第三十六页，共六十六页。 Farrington等用乙酸乙酯提取肝组织中5种苯并咪唑类残留,并用酸性氧化铝和C18柱净化,HPLC-UV分离测定,回收率在73%~90%。 Blanchflower等用甲醇-水(20+7)提取肝和肌肉组织中FBZ和OFZ,提取液用石油醚洗涤,经磷酸盐缓冲液稀释后,再用乙醚-乙酸乙酯(60+40)洗涤,FBZ和OFZ的回收率大于80%和70%。 Wilson等用乙酸乙酯提取肌肉和肝组织中8种苯并咪唑类残留。 Wilson方法被广泛应用于动物组织中苯并咪唑类残留的提取/净化。 第三十七页，共六十六页。 Hajee等对鳗鱼肉的均质液用磷酸盐缓冲液调节至pH7.5,发现只有在pH7.5~7.8之间,所有的MBZ标志残留物(MBZ、MBZ-OH、MBZ-NH2)呈中性,能被乙酸乙酯提取; 在SPE净化中分别采用正相和反相柱,发现氨基丙基柱较合适;在过氨基丙基柱前,先用正己烷调节乙酸乙酯提取液的极性,上样后,氨基丙基柱用异辛烷淋洗,再用甲醇洗脱;MBZ、MBZ-NH2和MBZ-OH的平均回收率分别为80%、60%和85%。 Cannavan等用乙酸乙酯提取肝、肾和肌肉组织均质液(调节至pH7.0)中T