核酸与蛋白质的研究方法.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 1995年，首次提出了蛋白组学的概念。其是蛋白质和基因组研究在形式和内容方面的结合，致力于研究某一物种、个体、器官或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质图谱。 基因组是相对固定的，但各个基因的表达调控与表达程度却有时空性。 蛋白质组与蛋白质组学技术 第五十五页，共六十页，2022年，8月28日 1975年首次建立了等电聚焦及SDS-聚丙烯酰胺凝胶双向电泳技术，该方法依赖于蛋白质分子的等电点和相对分子质量的差异。 目前，双向电泳的分辨率达到每块胶10000个蛋白白点。 双向电泳技术 第五十六页，共六十页，2022年，8月28日 第五十七页，共六十页，2022年，8月28日 蛋白质印迹法（Western blotting），又称为免疫印迹法（immunoblotting）,用于鉴定蛋白质，其原理是根据被测蛋白质能与特异性抗体结合的特性和该蛋白质的相对分子质量。 蛋白质印迹法 第五十八页，共六十页，2022年，8月28日 Western Blotting示意图 第五十九页，共六十页，2022年，8月28日 感谢大家观看 第六十页，共六十页，2022年，8月28日 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * DNA基本操作技术 核酸凝胶电泳技术 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。 第二十三页，共六十页，2022年，8月28日 一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。 第二十四页，共六十页，2022年，8月28日 生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。 由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。 第二十五页，共六十页，2022年，8月28日 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 第二十六页，共六十页，2022年，8月28日 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力 凝胶类型及浓度 分离DNA的大小范围（bp） 0.3%琼脂糖 50 000~1 000 0.7%琼脂糖 20 000~1 000 1.4%琼脂糖 6 000~300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000~100 10.0%聚丙烯酰胺 500~25 20.0%聚丙烯酰胺 50~1 第二十七页，共六十页，2022年，8月28日 在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05 ?g的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。 第二十八页，共六十页，2022年，8月28日 溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在300 nm波长的紫外光照射下发出荧光。 第二十九页，共六十页，2022年，8月28日 溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。 由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶 电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。 ? 第三十页，共六十页，2022年，8月28日 第三十一页，共六十页，2022年，8月28日 细菌转化与目标DNA分子的增殖 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌