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复习;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;打算将一个cDNA克隆到一个表达载体，以便在E.coli中大量制备相应的蛋白质。这个cDNA的两侧具有 BamHI的位点，因此计划将它从BamHⅠ的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行：载体用BamH Ⅰ切割以后，立即用碱性磷酸酶处理，除去5’磷酸。接着将处理过的载体同用BamH Ⅰ切割的 cDNA片段混合，加入DNA连接酶后进行温育，连接之后，将DNA同已处理过的可以接受DNA的细菌感受态细胞混合。最后，将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因，所以，转化的细菌能够存活。
实验中同时设置了4个对照：
对照1：将末同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上；
对着2：将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上；
对着3：将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有 cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上；
对照4：将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用 DNA连接酶连接(但没有 cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。
在进行第一次实验时，感受态细胞不是自己制备的，结果，在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落(表)。在第二次实验中，自己制备感受态细胞，但这一次，所有的平板上都没有菌落生长(表)。接着又进行了第三次实验，这次得到了转化子(表)。从实验平板上挑出12个菌落，分离了质粒DNA，并用BamHⅠ进行切割，其中9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带，另三个克隆中切出一个 cDNA片段，实验终于获得成功。
(l)你如何看待第一次的实验结果?对照1的目的是什么?
(2)影响第二次实验结果的原因是什么?对照2的作用何在?
(3)对照3和4各有什么作用?
(4)为什么要用碱性磷酸酶处理载体?
表 cDNA克隆的结果
制备的样品 实验结果
1 2 3
对照1 只有细胞 多到无法计数 0 0
对照2 未切??载体 多到无法计数 0 多到无法计数
对照3 省去磷酸酶处理，无cDNA 多到无法计数 0 435
对照4 无cDNA 多到无法计数 0 25
实验样品 多到无法计数 0 34
;;;;;
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