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腹水草水提液通过调控NF—κB信号通路抗乙醇对GES—1细胞的损伤 胃溃疡的发生与胃粘膜上皮细胞的损伤有着密切关系。当胃粘膜受到严重损伤时，胃粘膜上皮细胞的结构和功能被破坏，导致细胞增殖和死亡的失衡，进而导致胃溃疡、胃炎等疾病的发生。腹水草（Veronicastrum axillare）为玄参科腹水草属植物，具有逐水消肿，清热解毒，治臌胀、小便不利、大便不通等功效。前期研究表明，其水提液显著降低无水乙醇对大鼠胃粘膜的损伤。本文采用体外培养人胃上皮细胞GES-1细胞制备乙醇损伤细胞模型，研究腹水草水提液对GES-1细胞NF-κB信号通路的调控作用，为明确腹水草水提液抗胃溃疡的分子机制提供实验依据。 1.材料与方法 1.1 材料 腹水草水提液和雷尼替丁混悬液的制备方法见文献[3]。GES-1细胞株购自南京市科佰生物科技有限公司；DMEM高糖培养基购自HyClone公司；TNF-α、TNFR-1、IKBα、IKKβ和NF-κB ELISA试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；Trizol试剂、PrimeScriptTM?RT Master Mix、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ购自Takara公司。 1.2 方法 1.2.1 GES-1细胞的分组及造模 GES-1细胞的培养方法见文献[4]。取对数生长期的细胞，以1×106个/ml接种于6孔板，每孔2ml，培养24h后，弃原培养基，将细胞分为正常组、模型组、雷尼替丁组（45μg/ml）、腹水草高（80μg/ml）、中（40μg/ml）、低（20μg/ml）剂量组，每组6个复孔。正常组、模型组加入2ml培养基。雷尼替丁组、腹水草高、中、低剂量组分别加入含雷尼替丁、腹水草各浓度的培养基2ml。培养24h后弃培养基，正常组加2ml培养基，其余各组每孔加入2ml含5%乙醇的培养基，培养4h后，上清液转移到EP管中，3000r/min，离心10min，上清液用于检测TNF-α蛋白的表达水平。细胞板中的细胞和EP管中的沉淀用于细胞总蛋白和总RNA的提取。 1.2.2 ELISA检测NF-κB信号通路关键因子蛋白的表达 将各组细胞收集细胞于EP管中，1000r/min离心5min，去上清。沉淀中加入150μL含有蛋白酶抑制剂（PMSF）的RIPA裂解液，冰上裂解30min。4℃、12000r/min离心10min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。双抗体夹心ELISA检测GES-1细胞上清液中TNF-α和胞内TNFR-1、IκBα、IKKβ及NF-κB蛋白的表达量。 1.2.3 荧光定量RT-PCR检测NF-κB信号通路关键因子mRNA的表达 采用Trizol试剂提取总RNA，取0.5μg RNA采用Prime ScriptTM?RT Master Mix试剂盒进行逆转录，逆转录产物采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Kit扩增目的基因cDNA片段，PCR反应条件：95℃预变性30s，95℃5s，60℃30s，共40个循环，根据2-ΔΔCt法，以β-actin为内参基因分析 mRNA相对表达量。引物序列及产物大小见文献[4]。 1.2.4 统计学处理 所有数据以均数±标准差（±S）表示，单因素方差分析组间差异，LSD法两两比较，p＜0.05为有统计学意义。 2.结果 由图1可知，与正常组相比，模型组中TNF-α、TNFR-1、IκBα、IKKβ、NF-κB蛋白和mRNA表达量显著升高（p＜0.01），雷尼替丁组及腹水草低、中剂量组显著上调TNF-α、TNFR-1、IκBα、IKKβ、NF-κB mRNA的表达（p＜0.05或p＜0.01），腹水草水提液中、高浓度组IκBα蛋白表达量升高（p＜0.05或p＜0.01）；与模型组相比，雷尼替丁及腹水草各剂量均显著下调 TNF-α、TNFR-1、IκBα、IKKβ、NF-κB蛋白和mRNA表达水平（p＜0.05或p＜0.01），且呈剂量依赖性。