脂肪水解酶活性的测定.pdfVIP

脂肪水解酶活性的测定 脂肪水解酶 （EC，3.1.1.3）广泛存在于生物体中，能将甘油三酰水解为甘油及游离脂肪酸， 是脂肪异化作用中第一个参与反应的酶，所以一般认为是脂肪水解的调速酶。其催化反应如下： 游离脂肪酸可和碱性铜蓝结合成为铜皂。在有机溶剂中，铜皂和DPC （1，5-二苯卡巴肼，1， 5-diphenylcarbazide）定量结合，形成樱红色溶液。在游离脂肪酸含量为10～150mmol/L 的范围 内，与显色程度呈线性关系。可在550nm 处测定光密度变化，作为脂肪水解酶活性指标。 1.仪器设备 分光光度计、离心机、恒温水浴等。 2.操作方法 1）酶的粗提液制备：取萌发3～5d 的种子，如油菜、玉米等3～5g，加入2～5倍体积的0.15 mol/L Tricine 缓冲液 （含 1mmol/L EDTA，10mmol/LKCI，1mmol/L MgCl2，2mmol/LDTT， 用1.0mol/LKOH 调节pH 至7.5），在冰浴下研磨，匀浆用4 层纱布过滤后，1000×g 下离心10min， 除去浮在上面的脂肪层，取上清液测酶活。有的材料酶与脂肪体结合，此时可用乙醚抽提、离心， 除去乙醚后，再用上清液或悬浮液测酶活。 2）底物制备：一般用三油酸甘油酯或三亚油酸甘油酯，有时也可